酪氨酸酚裂解酶的固定化與轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

馬文靜， 周景文， 徐國(guó)強(qiáng)*

(1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122; 2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

L-酪氨酸是20種氨基酸中的一種，對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育及新陳代謝起著重要作用，常作為營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑、苯丙酮尿癥患者的必需氨基酸及以多巴、對(duì)羥基苯乙烯等醫(yī)學(xué)化工產(chǎn)品的制備原料，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和日化等領(lǐng)域[1-2]。酪氨酸也是構(gòu)成甲狀腺素的重要成分，酪氨酸與神經(jīng)元的傳遞有重要關(guān)系[3]。它常被用來治療憂郁癥，甲狀腺機(jī)能降低，也有助于細(xì)胞長(zhǎng)久保持年輕化，提高身體免疫力。隨著基因工程技術(shù)和酶工程技術(shù)的發(fā)展，生物合成L-酪氨酸將具有更加廣闊的應(yīng)用前景。固定化細(xì)胞是將具有生理功能的微生物細(xì)胞包裹在水不容的載體里，使其可循環(huán)利用，不斷反應(yīng)發(fā)酵的一種技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、制藥、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)等多種領(lǐng)域[4-5]。1989年，趙景聯(lián)[6]通過固定化大腸埃希菌來生產(chǎn)γ-氨基丁酸，可以使95%的谷氨酸被轉(zhuǎn)化成γ-氨基丁酸，也有人以聚乙烯醇作為固定化載體生產(chǎn)α淀粉酶[7]，還有通過固定化來生產(chǎn)乳酸[8]，用2%的海藻酸鈉固定乳桿菌，可以讓固定化球保持150 h的完整性，沒有破碎，使L-乳酸的產(chǎn)量達(dá)到45 g/L。本研究采用固定化細(xì)胞的方式，用全細(xì)胞酶法技術(shù)，充分利用酶活以獲得高產(chǎn)量的L-酪氨酸。常用的固定化方法主要有吸附法、共價(jià)法、交聯(lián)法和包埋法等[9-10]。L-酪氨酸的制備方法有3種：一種是從含有蛋白質(zhì)的物質(zhì)(酪蛋白和玉米等)水解液中提取獲得；一種是以葡萄糖為原料，以短桿菌突變育種發(fā)酵生產(chǎn)獲得；最后一種是以苯酚、丙酮酸和氨為底物利用酪氨酸酚裂解酶進(jìn)行酶法催化生產(chǎn)。而最早對(duì)于酶法合成L-酪氨酸由Yamada和Kumagai進(jìn)行了研究[11]。酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase，TPL)，也稱β-酪氨酸酶，是依賴于磷酸吡哆醛(PLP)的多功能酶，該酶能夠催化一系列的反應(yīng)。TPL在生物體外可將丙酮酸、氨和苯酚轉(zhuǎn)化產(chǎn)生L-酪氨酸，在生物體內(nèi)可將L-酪氨酸催化生成氨、丙酮酸和苯酚。該酶主要分布于腸細(xì)菌內(nèi)，也存在于一些嗜熱菌和節(jié)肢動(dòng)物體中，其中酶活較高的微生物主要是弗氏檸檬酸菌(Citrobacterfreundii)、草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)以及嗜熱菌(Symbiobacteriumthermophilum)等[12-13]。關(guān)于酶法合成L-酪氨酸的研究已有較多報(bào)道[14-15]，另外，?？】〉萚16-17]利用TPL全細(xì)胞催化丙酮酸或者L-絲氨酸合成酪氨酸，以0.1 mol/L丙酮酸和0.1 mol/L苯酚為底物，反應(yīng)24 h后，酪氨酸產(chǎn)量為16.17 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)78.6%。本研究考慮到固定化細(xì)胞具有可循環(huán)利用、易于制備和分離等優(yōu)勢(shì)，將固定化細(xì)胞技術(shù)與酶法生產(chǎn)L-酪氨酸的過程結(jié)合在一起，減少了酶的活力損失，同時(shí)大大降低了成本，從而合成更多的L-酪氨酸。分別用海藻酸鈉、明膠、聚乙烯醇及兩者混合物為載體，通過優(yōu)化載體濃度及發(fā)酵過程的條件，以期獲得L-酪氨酸的高效生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 以歐文氏菌(Escherichiaherbicola)為來源的酪氨酸酚裂解酶的重組大腸埃希菌E.coliBL21。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0；TB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 12 g/L，酵母提取物 24 g/L，甘油 5 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，pH 7.0；固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加2%瓊脂粉。

1.1.3 儀器與設(shè)備 酵母抽提物和蛋白胨，Oxoid公司；其余化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。FE20K pH計(jì)，瑞士Mettler-Toledo公司；Eppendorf 5424高速離心機(jī)，美國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 從平板上挑取單菌落在LB種子培養(yǎng)基(kanamycin抗性)中培養(yǎng)10 h，將活化好的種子液以1%(體積比)接種量接入含25 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)基中含終質(zhì)量濃度50 mg/L的氨芐霉素，37 ℃搖床培養(yǎng)2 h，加入終濃度0.2 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)，20 ℃誘導(dǎo)16 h。培養(yǎng)結(jié)束后于7 000 r/min離心收集菌體細(xì)胞。

1.2.2 固定化技術(shù) 將收集的菌體用生理鹽水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的菌體懸液，與無菌海藻酸鈉溶液按體積比為1∶1的比例混合均勻，制備好的菌懸液用電子蠕動(dòng)泵滴落到配制好的無菌CaC12溶液中形成凝珠，將制好的固定化細(xì)胞4 ℃靜置2 h后，過濾收集固定化細(xì)胞備用。

1.2.3 固定化細(xì)胞培養(yǎng) 將以1 g濕菌體制作的凝膠球加入20 mL的反應(yīng)體系：氯化銨 0.65 mol/L，苯酚 0.1 mol/L，丙酮酸鈉 0.1 mol/L，磷酸吡哆醛0.15 μmol/L，曲拉通(Triton X-100)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH為8.0，20 ℃、220 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后加入10 mol/L氫氧化鈉溶解L-酪氨酸，用高效液相色譜檢測(cè)L-酪氨酸含量。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：WondaSil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：V(0.1 mmol/L醋酸鈉溶液，醋酸調(diào)節(jié)pH=4.0)∶V(100%甲醇)= 9∶1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

1.2.5 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，載體濃度、反應(yīng)時(shí)間、苯酚濃度和碳酸鈣4個(gè)因素對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)L-酪氨酸的影響較為顯著，因此采用這4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

注：%表示質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化細(xì)胞載體的選擇

用來做固定化細(xì)胞的載體有很多，考慮到價(jià)格、成本、危險(xiǎn)性以及操作的難易程度，選擇海藻酸鈉、明膠和聚乙烯醇(polyvinylalcohol，PVA)等作為固定化細(xì)胞的載體，以戊二醛[18-20]為交聯(lián)劑，采用包埋和交聯(lián)結(jié)合的方法進(jìn)行固定化。分別制作以海藻酸鈉、海藻酸鈉-明膠和海藻酸鈉-PVA為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑的固定化細(xì)胞，反應(yīng)結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，載體中添加戊二醛固定化對(duì)TPL的影響較大，幾乎沒有目的產(chǎn)物L(fēng)-酪氨酸的積累，而不添加戊二醛的載體中，混合載體海藻酸鈉-明膠的效果比單一載體海藻酸鈉好，總產(chǎn)量能夠達(dá)到15.4 g/L。

2.2 固定化細(xì)胞載體濃度的選擇

制作以海藻酸鈉和不同濃度明膠的混合載體為載體，分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%、8%、10%、12%、14%的明膠與4%的海藻酸鈉作為混合載體，結(jié)果如圖2所示。隨著明膠濃度的增加，L-酪氨酸的產(chǎn)量開始提高，但明膠濃度繼續(xù)增加時(shí)，L-酪氨酸的產(chǎn)量開始下降然后再上升，但上升的幅度不大，當(dāng)6%濃度明膠與4%海藻酸鈉為混合載體時(shí)，L-酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最高為17.1 g/L，比4%海藻酸鈉高13.3%。

圖1 不同載體對(duì)固定化生產(chǎn)L-酪氨酸的影響Fig.1 The influence of different carrier on the immobilized production of L-tyrosine1:4%海藻酸鈉+4%氯化鈣；2:4%海藻酸鈉+6%明膠+4%氯化鈣；3:4%海藻酸鈉+4%氯化鈣+10%PVA+硼酸；4：4%海藻酸鈉+10%PVA+4%氯化鈣；5：4%海藻酸鈉+4%氯化鈣+10%明膠；%表示質(zhì)量分?jǐn)?shù)；2和4表示兩種載體先混合再與菌體混合滴入氯化鈣中，3和5表示單獨(dú)海藻酸鈉與菌體混合再滴入氯化鈣成球后用明膠或PVA包裹成型1:4% sodium alginate + 4% calcium chloride； 2: 4% sodium alginate + 6% gelatin + 4% calcium chloride； 3: 4% sodium alginate + 4% calcium chloride + 10% PVA + boric acid； 4: 4% sodium alginate + 10% PVA + 4% calcium chloride； 5: 4% sodium alginate + 4% calcium chloride + 10% gelatin. % represents the quality score; 2 and 4 indicate that the two carriers were first mixed with bacteria and then dribbled into calcium chloride; 3 and 5 indicate that sodium alginate alone was mixed with bacteria and then dribbled into calcium chloride and formed into a ball, which was then coated with gelatin or PVA

圖2 載體濃度對(duì)固定化生產(chǎn)L-酪氨酸的影響Fig.2 The influence of carrier concentration on the immobilized production of L-tyrosine

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸的影響

分別制作以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%海藻酸鈉、4%海藻酸鈉與6%明膠為混合載體的固定化細(xì)胞，取不同反應(yīng)時(shí)間5、10、12 h，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)L-酪氨酸的影響。如圖3所示，以4%海藻酸鈉為對(duì)照，4%海藻酸鈉+6%明膠為載體的固定化細(xì)胞發(fā)酵， 5 h時(shí)L-酪氨酸的產(chǎn)量為14.5 g/L，10 h時(shí)L-酪氨酸的產(chǎn)量為17.9 g/L，而12 h時(shí)的產(chǎn)量為17.1 g/L，考慮到擴(kuò)大生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸的最佳時(shí)間為10 h。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定化生產(chǎn)L-酪氨酸的影響Fig.3 The influence of reaction time on the immobilized production of L-tyrosine

2.4 苯酚濃度對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸的影響

苯酚作為生產(chǎn)L-酪氨酸的反應(yīng)底物之一是不可或缺的，但有文獻(xiàn)[21-23]報(bào)道，當(dāng)苯酚濃度超過反應(yīng)體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1%時(shí)，酪氨酸酚裂解酶的活性就會(huì)受到影響，為減少這種影響，取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L的苯酚，考察不同濃度的苯酚對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)L-酪氨酸的影響，結(jié)果如圖4。從圖4可以看出，苯酚濃度在0.08 mol/L時(shí)，L-酪氨酸的產(chǎn)量最高為32.9 g/L，苯酚在低質(zhì)量濃度時(shí)，隨著苯酚濃度的增加，L-酪氨酸的產(chǎn)量升高，繼續(xù)增加時(shí)，反而對(duì)底物有抑制作用，目的產(chǎn)物開始下降，故發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸時(shí)，反應(yīng)底物苯酚的最佳濃度為0.08 mol/L。

2.5 二氧化硅對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸的影響

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%海藻酸鈉與6%明膠混合載體的固定化細(xì)胞，在海藻酸鈉中添加一定量的二氧化硅[24-25]，由于固定化球在經(jīng)過幾次的反應(yīng)后會(huì)出現(xiàn)破碎裂解的情況，故在固定化球中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的二氧化硅，制作固定化球，考察二氧化硅對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)L-酪氨酸的影響。從圖5可以看出，在載體中添加二氧化硅對(duì)固定化發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸有一定的作用，二氧化硅濃度增加到1.5%時(shí)，產(chǎn)物的產(chǎn)量達(dá)到34.9 g/L，繼續(xù)增加，產(chǎn)量逐漸降低，故在海藻酸鈉中添加1.5%二氧化硅對(duì)于固定化球的機(jī)械強(qiáng)度以及L-酪氨酸的產(chǎn)量有一定的提高。

圖4 苯酚濃度對(duì)固定化生產(chǎn)L-酪氨酸的影響Fig.4 The influence of phenol concentration on the immobilized production of L-tyrosine

圖5 二氧化硅對(duì)固定化生產(chǎn)L-酪氨酸的影響Fig.5 The influence of silica on the immobilized production of L-tyrosine

2.6 硅藻土對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸的影響

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%海藻酸鈉與6%明膠混合載體的固定化細(xì)胞，在海藻酸鈉中添加一定量的硅藻土[24-25]，取不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的硅藻土，考察硅藻土對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)L-酪氨酸的影響。由于固定化球在經(jīng)過幾次的反應(yīng)后會(huì)出現(xiàn)破碎裂解的情況，故在固定化球中添加硅藻土，制作固定化球，從圖6可以看出，硅藻土的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，L-酪氨酸的產(chǎn)量最高為48 g/L。

圖6 硅藻土對(duì)固定化生產(chǎn)L-酪氨酸的影響Fig.6 The influence of diatomite on the immobilized production of L-tyrosine

2.7 碳酸鈣對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸的影響

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%海藻酸鈉與6%明膠為混合載體的固定化細(xì)胞，在海藻酸鈉中添加一定量的碳酸鈣[24-5]，由于固定化球在經(jīng)過幾次的反應(yīng)后會(huì)出現(xiàn)破碎裂解的情況，故在固定化球中分別添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的碳酸鈣，制作固定化球，考察碳酸鈣對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)L-酪氨酸的影響。從圖7以可看出，碳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)，L-酪氨酸的產(chǎn)量最高為62.6 g/L，而不添加碳酸鈣時(shí)，L-酪氨酸的產(chǎn)量只有49.1 g/L，故在載體中添加碳酸鈣對(duì)于固定化發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸有一定的作用，對(duì)比三種輔助劑碳酸鈣、二氧化硅和硅藻土，碳酸鈣的效果最好。

圖7 碳酸鈣對(duì)固定化生產(chǎn)L-酪氨酸的影響Fig.7 The influence of calcium carbonate on the immobilized production of L-tyrosine

2.8 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。從表2可以看出，對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量影響因素主次順序?yàn)楸椒訚舛?反應(yīng)時(shí)間>碳酸鈣>載體濃度。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到固定化細(xì)胞生產(chǎn)L-酪氨酸較優(yōu)條件：載體為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%海藻酸鈉與6%明膠的混合載體，反應(yīng)時(shí)間8 h，苯酚濃度0.08 mol/L，碳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，L-酪氨酸的產(chǎn)量64.5 g/L，而單獨(dú)使用海藻酸鈉為載體制作的固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)所獲得的L-酪氨酸只有11.7 g/L，可見優(yōu)化后L-酪氨酸的產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了451.3%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

3 討 論

本研究采用海藻酸鈉和明膠作為混合載體進(jìn)行固定化，其操作簡(jiǎn)便、材料易得、安全性高。通過單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)影響L-酪氨酸產(chǎn)量的主要因素為苯酚，其次為反應(yīng)時(shí)間、碳酸鈣和載體濃度，最終確定以質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%海藻酸鈉和6%明膠作為混合載體對(duì)大腸埃希菌細(xì)胞進(jìn)行固定化，于載體中添加碳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%制作固定化細(xì)胞，在苯酚濃度為0.08 mol/L條件下進(jìn)行，最適反應(yīng)時(shí)間為8 h，固定化細(xì)胞在連續(xù)反應(yīng)9次后，L-酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到64.5 g/L，對(duì)比優(yōu)化前提高了451.3%，為固定化細(xì)胞生產(chǎn)L-酪氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。結(jié)果顯示，隨著固定化球反應(yīng)次數(shù)的增多，酶的催化力下降，即酶活下降。其原因可能是苯酚的致毒性與腐蝕性，固定化細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間浸泡在含有苯酚的反應(yīng)液中，致使其局部蛋白質(zhì)變性，從而使酶喪失活性，轉(zhuǎn)化率降低，這種推測(cè)還有待進(jìn)一步探索。