miR-21調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路抑制增生性瘢痕形成的機制研究

史敏 李娜 郭曉波 等

[摘要]目的：探討miR-21對增生性瘢痕中PTEN表達和成纖維細胞增殖的影響，以期為增生性瘢痕的臨床診斷和治療提供新靶點。方法：分別用qPCR和Western blot檢測增生性瘢痕（HTS）組織和細胞中miR-21及PTEN的表達;雙熒光素酶報告基因檢測驗證miR-21與PTEN的調(diào)控關(guān)系;Western blot檢測miR-21對增生性瘢痕成纖維細胞（HSF）中PTEN蛋白表達影響;MTT檢測細胞增殖能力變化。結(jié)果：HTS組織中miR-21高表達，PTEN低表達;雙熒光素酶報告實驗和Western blot證實了miR-21對PTEN的靶向調(diào)控作用;下調(diào)miR-21可增加PTEN的表達，從而可抑制PI3K/Akt通路活性，抑制HSF細胞增殖。結(jié)論：本研究證實了miR-21具有診斷和治療HTS的潛能，并為臨床提供可能的新靶點。

[關(guān)鍵詞]miR-21;PTEN;增生性瘢痕;HSF;細胞外基質(zhì);PI3K/Akt

[中圖分類號]R364.3+3? ? [文獻標識碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）03-0092-03

Abstract： Objective? To investigate the effect of miR-21 on PTEN expression and fibroblast proliferation in hypertrophic scar， in order to provide a new target for clinical diagnosis and treatment of hypertrophic scar. Methods? The expression of miR-21 and PTEN in HTS tissues and cells were detected by qPCR and western blot， respectively. Dual luciferase reporter gene assay to verify the regulatory relationship between miR-21 and PTEN. Western blot analysis of the effect of miR-21 on the expression of PTEN protein in HSF cells. MTT assay for cell proliferation.? Results? High expression of miR-21 and low expression of PTEN in HTS tissues. Dual luciferase reporter assay and western blot confirmed the targeted regulation of miR-21 on PTEN. Down-regulation of miR-21 inhibits PI3K/Akt pathway activity and up-regulates HSF cell proliferation by up-regulating PTEN expression. Conclusion? This study demonstrates the potential of miR-21 to diagnose and treat HTS and may provide new targets for clinical use.

Key words： miR-21; PTEN; hypertrophic scars; hypertrophic scar fibroblasts; extracellular matrix; PI3K/Akt

增生性瘢痕（hypertrophic scar，HTS）是臨床常見的皮膚疾病，多見于燒傷、皮膚創(chuàng)傷及術(shù)后[1]，其治療是一項棘手的問題。HTS不僅影響患者美觀，易造成患者心理障礙，而且可引起身體機能受損甚至殘疾。據(jù)統(tǒng)計，皮膚創(chuàng)傷后HTS的發(fā)病率可達40%～70%，而燒傷后更高達91%[2]。在皮膚傷口愈合過程中，成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)B）膠原分泌代謝過程受到嚴格調(diào)控，但在HTS形成過程中這種平衡狀態(tài)被破壞，F(xiàn)B大量增殖，膠原過度合成、分泌，并沉積在細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），導致HTS形成[3]。雖然目前臨床上HTS的防治有許多方法，但因其形成機制不明確，效果不佳。人們從分子水平探求抑制瘢痕成纖維細胞增殖機制，以尋找有效的治療靶標，從而防止瘢痕形成。

瘢痕增生受多基因調(diào)控，目前已確定了部分瘢痕形成易感基因位點的表達調(diào)控，但機制不明確。微小RNA（microRNA或miRNA）是一類由18～22個核苷酸構(gòu)成的微小非編碼RNA，其廣泛的基因調(diào)節(jié)功能已被證實在多種皮膚病中參與調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖、分化和ECM合成過程[4-5]。據(jù)報道，在瘢痕疙瘩組織中miR-21高表達，可促進成纖維細胞膠原分泌及細胞增殖[6]。在多種纖維化疾病中已經(jīng)證實miR-21顯著高表達，如心肌、腎和肺纖維化[7]。PTEN是繼P53后發(fā)現(xiàn)的另一腫瘤抑制基因，是PI3K/Akt通路公認的負性調(diào)節(jié)蛋白，在腫瘤中發(fā)揮抑癌因子作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕組織成纖維細胞PTEN表達低于正常皮膚成纖維細胞，且脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可降低正常FB中PTEN表達，提示PTEN表達增多可能會抑制HTS形成[8]。在肺癌組織中，miR-21可靶向抑制PTEN表達，從而促進肺癌細胞增殖侵襲[9]，然而miR-21是否通過靶向PTEN參與增生性瘢痕組織形成仍然未知，因此本研究將在人增生性瘢痕中揭示miR-21對PTEN作用關(guān)系和FB增殖的影響，從而為增生性瘢痕的臨床診斷及治療提供實驗依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 材料：正常人皮膚成纖維細胞（GM0639）和人增生性瘢痕成纖維細胞（hypertrophic scar fibroblasts，HSF），提取試劑盒（mirVana? miRNA Isolation Kit）、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit）及miRNA定量檢測試劑盒（TaqMan? MicroRNA Assays）、LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體均購自Invitrogen公司;總RNA提取試劑RNAiso Plus、qPCR試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTM）均購自TaKaRa;Dual Luciferase?Reporter Assay System購于Promega公司;RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物;胎牛血清、RPMI1640、Opti-MEM、青鏈霉素購自Gibco公司;PTEN購自CST;GAPDH和HRP標記二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 標本收集：收集2015年2月-2018年2月陜西省西安市中心醫(yī)院患者手術(shù)切除的增生性瘢痕組織及鄰近正常皮膚組織，取材前得到患者本人或家屬簽署的知情同意書，患者在手術(shù)前1年內(nèi)未接受任何治療，并且無系統(tǒng)性疾病，無腫瘤病史。經(jīng)術(shù)后病理檢查均證實為增生性瘢痕組織，其中男42例、女25例，所有取材操作均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 qPCR檢測：用miRNA提取試劑盒（mirVana? miRNA Isolation Kit）提取總miRNA，酶標儀測定miRNA濃度，按照miR-21逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit）及miR-21定量檢測試劑盒（TaqMan?MicroRNA Assays）檢測miR-21的相對表達水平，以U6為內(nèi)參;用RNA提取試劑RNAiso Plus提取總RNA，酶標儀測定總RNA濃度，按照qPCR試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTM）進行PTEN定量檢測，以GAPDH為內(nèi)參。引物如下，PTEN引物：CATCCTGCAGAAGAAGCC和TGCTTTGAATCCAAAAACCTTA;GAPDH引物：GTGGGCATCAATGGATTTGG和CACCATGTATTCCGGGTCAAT，用2-ΔΔCt法計算PTEN和miR-21相對表達情況。

1.4 Western blot檢測：將處理細胞加裂解液裂解，12 000g離心15min，BCA法進行蛋白定量。取適量蛋白加上樣緩沖液配制蛋白樣品，95℃變性后使用10% SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，PTEN和GAPDH一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜2次，加二抗稀釋液室溫孵育2h，TBST洗膜2次，于暗室中用化學發(fā)光液ECL對條帶進行曝光顯影，Image J軟件測蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算各個蛋白相對表達量。本步驟重復3次。

1.5 雙熒光素酶報告實驗：使用PCR擴增PTEN并克隆到pmirGLO構(gòu)建報告載體，用Stratagene點突變試劑盒突變pmirGLO-PTEN-WT上miR-21結(jié)合位點，構(gòu)建pmirGLO-PTEN-Mut報告載體。將質(zhì)粒miR-21或miR-NC轉(zhuǎn)染至293T細胞，48h后用Dual Luciferase?Reporter Assay System試劑盒檢測各組細胞海腎熒光素酶活性。

1.6 細胞培養(yǎng)：GM0639和HSF培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，293T細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM中，細胞均放置于含5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染前先進行細胞傳代，次日待有40%的融合度再進行培養(yǎng)。根據(jù)處理方法的不同，將HSF細胞分為空白對照組（Blank組）、陰性對照組（miR-NC組）和miR-21 Inhibitor組。

1.7 MTT檢測細胞增殖：將處理后的細胞接種于96孔板，每組設置3個復孔，采用MTT法測貼壁細胞不同時間點的活力。每孔加入5mg/ml MTT 20μl，37℃培養(yǎng)4h棄去培養(yǎng)液，各孔加入150μl DMSO，室溫、避光搖床震蕩12min，充分溶解結(jié)晶物。以空白孔為對照，酶標儀檢測490nm波長處吸光度值，以吸光度值大小反映細胞增殖能力，每組實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x?±s）表示，兩組數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1 miR-21在增生性瘢痕組織中表達：經(jīng)qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚組織相比，miR-21在增生性瘢痕組織中表達明顯增加（P<0.01），見圖1。

2.2 PTEN在增生性瘢痕組織中表達：Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚組織相比，增生性瘢痕組織中PTEN表達顯著降低（P<0.01），見圖2。

2.3 miR-21對PTEN表達的影響：應用miR-21、miR-21模擬物，陰性對照瞬時轉(zhuǎn)染后檢測發(fā)現(xiàn)，miR-21與miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-21后HSF內(nèi)源性miR-21表達顯著下降（P<0.01），（見圖3）;而PTEN顯著增加（P<0.01），（見表1）。因此，miR-21可靶向抑制PTEN的表達。

2.4 miR-21對HSF增殖能力的影響：MTT檢測轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后對HSF增殖能力影響。結(jié)果可見，與miR-NC相比，下調(diào)miR-21后第2天、第3天可顯著抑制HSF增殖能力（P<0.01）。由此可知，下調(diào)miR-21可通過PTEN進而抑制HSF增殖能力。見圖4。

3? 討論

HTS是皮膚創(chuàng)傷后組織自我修復過度的異常愈合結(jié)果，組織學表現(xiàn)為FB大量增殖和膠原分泌及ECM過度聚集沉積。HTS的發(fā)病機制和防治一直是長期困擾整形外科的難題之一。由于瘢痕形成機制復雜、影響因素廣泛，至今尚不明確，因此治療缺乏針對性，目前臨床上常規(guī)的治療方法較多但效果差強人意。

瘢痕增生發(fā)病機制研究的開展已深入到細胞、分子和基因水平，部分瘢痕易感基因位點已被確定，且已證實PI3K/Akt、TGF-β-smads信號途徑、MAPK均參與了瘢痕增生的形成。近期研究表明，在人體組織中FB的增殖、分化和ECM合成中都有miRNA的參與調(diào)節(jié)。已經(jīng)證實，miR-21在器官纖維化疾病中存在高表達[10-11]，且參與了纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展。張奇[12]對創(chuàng)傷愈合研究表明，HTS組織中miR-21表達量顯著增高，進而促使TGF-β表達，導致膠原和ECM的過度沉積和HTS形成。研究表明[13]，miR-21可通過靶向Smad7促進增生性瘢痕形成，促進細胞外基質(zhì)合成，慕生枝等[14]經(jīng)下調(diào)miR-21通過PDCD4抑制人增生性瘢痕成纖維細胞增殖。彭燕[15]在體外培養(yǎng)人增生性瘢痕FB的研究表明，與正常皮膚相比，人增生性瘢痕FB中的miR-21、TGF-β1表達顯著升高，miR-21與TGF-β1呈正相關(guān)。在本研究中，筆者也證實，與正常皮膚組織相比，miR-21在HTS組織中顯著低表達，這與彭燕等的研究結(jié)果一致。

PTEN基因定位于10q23.3，其編碼的蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，它是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重磷酸酶活性的抑制基因。PTEN通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt、MAPK細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑抑制腫瘤細胞分化、周期停滯及細胞凋亡，從而發(fā)揮抑癌的關(guān)鍵性作用[16]。研究表明，PTEN突變或缺失與多種癌癥如胃癌、肺癌等發(fā)生有關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在特發(fā)性肺纖維化組織及風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織的成纖維細胞中低表達，而過表達可抑制纖維化肺組織中FB的增殖并誘導其凋亡[18]。最近報道，瘢痕組織FB中PTEN表達低于正常皮膚，且LPS可降低正常FB中PTEN表達[8]，提示提高PTEN表達則可能抑制HTS形成。生物信息學及文獻報道證實，miR-21對器官、組織及FB的增殖和ECM合成具有顯著調(diào)節(jié)作用，說明miRNA對瘢痕增生的作用可能是多因素綜合所致。本研究也證實了在正常皮膚組織和HTS組織中miR-21的表達存在顯著差異，HTS組織中miR-21的表達顯著增高而PTEN低表達，下調(diào)miR-21后PTEN表達升高，且miR-21可抑制FB增殖。然而miR-21和PTEN的作用模式，諸如靶基因的預測和驗證仍需進一步研究。

綜上所述，miR-21是HTS形成的重要調(diào)節(jié)因子之一，臨床上可通過抑制miR-21來診斷治療HTS。

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[收稿日期]2018-12-24

本文引用格式：史敏，李娜，郭曉波，等.miR-21調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路抑制增生性瘢痕形成的機制研究[J].中國美容醫(yī)學，2019，28（3）：92-95.