黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析及分子標記開發(fā)

尹 躍，安 巍，趙建華，王亞軍，樊云芳，曹有龍

（寧夏農(nóng)林科學院 國家枸杞工程技術研究中心，寧夏 銀川750002）

黑果枸杞Lycium ruthenicum是茄科Solanaceae枸杞屬Lycium植物，主要分布在中國西北地區(qū)［1］，野生種質(zhì)資源非常豐富，耐干旱耐鹽堿；其果實富含類黃酮、花青素、多糖、酚酸和脂肪酸等生物活性物質(zhì)，具有預防多種疾病的功效［2］，深受消費者喜愛。目前，對黑果枸杞果實活性物質(zhì)的研究較多［2-3］。也有研究利用擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）［4］，簡單重復序列間擴增多態(tài)性（ISSR）［5］和相關序列擴增多態(tài)性（SRAP）［6］標記進行遺傳多樣性評價，但鮮有利用簡單重復序列（SSR）標記的報道。SSR標記是基于生物基因組中由1～6個核苷酸組成的串聯(lián)重復序列特性開發(fā)的分子標記，具有多態(tài)性豐富、高通量檢測、共顯性遺傳等優(yōu)點，已廣泛應用遺傳圖譜構(gòu)建、分子標記輔助育種、種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析等［7-10］領域。由于缺乏基因組信息，基于基因組測序開發(fā)黑果枸杞SSR標記成本高，步驟繁瑣［11-12］，SSR標記在黑果枸杞種質(zhì)資源研究中的應用受到限制。同時，美國生物技術信息中心（NCBI）中公布的黑果枸杞表達序列標簽（EST）極少，除了CHEN等［16］研究了基于鹽脅迫下黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組表達序列標簽-簡單重復序列（EST-SSR）標記開發(fā)之外，基于轉(zhuǎn)錄組測序黑果枸杞EST-SSR標記開發(fā)尚未見報道。EST-SSR來源于表達的基因組區(qū)域，可直接反映相關基因多樣性，在不同物種間具有良好的通用性；隨著高通量測序技術和生物信息學方法快速發(fā)展，基于轉(zhuǎn)錄組測序已開發(fā)刺梨Rosa roxburghii，中國櫻桃Cerasus pseudocerasus，馬鈴薯Solanum tuberosum等［13-15］多種植物的SSR標記。本研究以前期黑果枸杞抗旱轉(zhuǎn)錄組測序獲得的數(shù)據(jù)為基礎，利用生物信息學方法批量開發(fā)EST-SSR標記，并分析其分布特點、組成特征，以期為黑果枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性分析研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

取1年生黑果枸杞持續(xù)干旱脅迫下的葉和根，提取RNA后進行轉(zhuǎn)綠組測序（無參，HiSeqTM2500，北京諾禾致源生物信息科技有限公司），共12個樣本，計80 G數(shù)據(jù)。利用Trinnity等軟件［17］對測序的數(shù)據(jù)進行拼接和組裝，獲得213 058條單基因簇（unigene）作為背景數(shù)據(jù)進行分析。

1.2 植物材料及DNA提取

用于SSR引物篩選及評價的24份枸杞種質(zhì)資源（表1）均來自寧夏農(nóng)林科學院國家枸杞工程技術研究中心枸杞種質(zhì)資源圃（38°38′49″N， 106°9′10″E）。 利用天根試劑盒（DP5-02， 天根）提取基因組DNA。

1.3 轉(zhuǎn)錄組SSR位點鑒別及引物設計

使用MISA軟件（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）搜索Unigene序列的SSR位點。搜索標準為：重復單元長度1～6 bp，單核苷酸重復次數(shù)≥10次，二核苷酸重復次數(shù)≥6次，三、四、五、六核苷酸重復次數(shù)≥5次，復合型SSR位點堿基間隔≤100 bp。

采用BatchPrimer 3軟件（https://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/）對獲得的SSR位點批量設計引物。引物設計參數(shù)為：引物長度18～27 bp（最佳22 bp），GC為40%～70%（最適50%），退火溫度為50～60℃（最適55℃），PCR擴增產(chǎn)物長度為100～300 bp，其他參數(shù)為默認設置。

1.4 EST-SSR引物篩選及驗證

隨機挑選128對引物，在上游引物 5′端添加18 bp的 M13通用引物序列（TGTAAAACGACGGCCAGT），3′端保持不變，用FAM熒光集團修飾后，由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

PCR擴增體系（15.0 μL）：DNA模板1.0 μL，M13通用熒光引物0.1 μL，上游引物和下游引物各0.4 μL， 2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL， 雙蒸水 5.6 μL。 PCR 擴增在 ABI-2720（應用生物系統(tǒng)公司， 美國）上進行。擴增程序為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60～45℃ 30 s，72℃ 30 s，15個循環(huán)；95℃ 30 s，50℃30 s，72℃30 s，20個循環(huán)；72℃7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)過ABI3730XL DNA（應用生物系統(tǒng)公司，美國）檢測，用LIZ500作為分子量內(nèi)標。

表1 供試種質(zhì)材料信息Table 1 Information of twenty-four materials used in this study

1.5 數(shù)據(jù)分析

以SSR出現(xiàn)頻率和SSR平均分布距離描述EST-SSR。公式如下：①SSR出現(xiàn)頻率fc＝c/n×100%，其中c為搜索到的SSR數(shù)量（個），n為無余EST數(shù)量（個）。②SSR平均分布距離fN＝N/c，其中N為無余EST數(shù)量的總堿基數(shù)（個）。由GeneMapper 4.0軟件獲得擴增產(chǎn)物片段大小，用DataFormater 2.7軟件［18］將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為PowerMarker v3.25軟件［19］的輸入格式，計算等位基因數(shù)（number of alleles，NA）、主效等位基因頻率（major allele frequency,fMA）、 期望雜合度（expected heterozygosity，HE）、 觀察雜合度 （observed heterozygosity，HO）和多態(tài)信息量（polymorphism information content，CPI）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的分布特點

利用MISA軟件對黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組測序獲得的213 058條Unigene（序列總長度為262 643 598 bp）序列進行搜索，發(fā)現(xiàn)其中56 170條Unigene序列中含有73 896個SSR位點，其中13 611條Unigene含有2個或2個以上EST-SSR位點?？傮w上，SSR發(fā)生頻率為26.36%，平均3.55 kb出現(xiàn)1個SSR位點。SSR類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復類型均存在；單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復出現(xiàn)頻率占優(yōu)勢，分別占總SSR的74.33%，13.30%和11.81%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復類型數(shù)量較少，分別占總數(shù)的0.49%，0.03%和0.04%（表2）。

表2 黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR數(shù)量、類型和頻率Table 2 Frequencies of the different SSR repeat motif types observed in the Lycium ruthenicum transcriptome

2.2 轉(zhuǎn)錄組SSR基序重復類型和頻率特征

從黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR核苷酸基序重復類型來看，73 896個SSR位點共有84種重復基元，單核苷酸至六核苷酸重復分別有2，4，10，26，18和24種。從出現(xiàn)的頻率來看（表3）：占優(yōu)勢的前3種重復單元類型是單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復基元；單核苷酸重復基元以A/T為主，占該類型SSR位點總數(shù)的95.64%；二核苷酸主要以AG/CT為主，占二核苷酸總數(shù)的40.42%，其次是AT/AT，AC/GT和CG/CG，分別所占比例為35.37%，23.74%和0.46%；三核苷酸重復單元以AAC/GTT，AAG/CTT，AAT/ATT，ATC/ATG和ACC/GGT為主，占所有三核苷酸重復單元的75.88%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復單元類型較為分散，出現(xiàn)頻率相對較低，僅為0.56%。

表3 黑果枸杞EST-SSR中重復基元的類型、數(shù)量及頻率Table 3 Number and frequencies of repeat motif types in Lycium ruthenicum

2.3 SSR引物有效性及多態(tài)性檢測

為檢測所開發(fā)的EST-SSR標記的可用性，對56 170條Unigene序列的73 896個EST-SSR位點設計引物，共得到引物12 674對。隨機挑選128對（包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸），以表型性狀差異較大的 ‘黑果枸杞’ ‘寧杞1號’ ‘寧杞菜1號’和 ‘中國枸杞’的DNA為模板進行PCR擴增，其中74對引物能擴增出清晰的擴增產(chǎn)物，引物擴增有效率為57.8%；其中28對引物具有多態(tài)性，多態(tài)性引物占有效引物的37.8%。圖1為引物LM-02對4份種質(zhì)的基因型圖。

2.4 SSR位點遺傳多樣性分析

以篩選的28對多態(tài)性引物對24份枸杞種質(zhì)作遺傳多樣性分析。共檢測到等位基因256個，各引物檢測到的等位基因為4～19個，平均為9.1個；共檢測到基因型數(shù)303個；主效等位基因頻率變化范圍為0.188～0.729，平均值為0.432；觀察雜合度為0.167～0.833，平均值為0.439；期望雜合度為0.433～0.904，平均值為0.712，多態(tài)信息量為0.395～0.897，平均值為0.678。由Botstein理論［20］判定（表4），在開發(fā)出的28個多態(tài)位點中有24個高度多態(tài)位點（CPI≥0.5），4個中度多態(tài)位點（0.25≤CPI＜0.5）。

3 討論

本研究搜索了黑果枸杞的213 058條Unigene序列，發(fā)現(xiàn)其中的56 170條中含有73 896個SSR位點，發(fā)生頻率為26.36%；高于中國櫻桃Cerasus pseudocerasus（15.62%）［14］，馬鈴薯Solanum tuberosum（3.43%）［15］， 夏蠟梅Sinocalycanthus chinensis（21.25%）［16］， 馬尾松Pinus massoniana（4.69%）［23］和中間錦雞兒Caragana intermedia（14.78%）［24］， 低于藍靛果忍冬Lonicera caeruleavar.edulis（32.51%）［25］， 山桐子Idesia polycarpa（35.00%）［26］， 普通油茶Camellia oleifera（39.67%）［27］和芙蓉李Prunus salicina（54.51%）［28］?？梢?，不同物種轉(zhuǎn)錄組SSR位點的出現(xiàn)頻率不同，出現(xiàn)差異的原因除了物種本身差異，還可能與分析數(shù)據(jù)庫大小、SSR挖掘工具及搜索條件有關［13］。

從重復單元頻率來看，黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組的SSR主要類型為單核苷酸重復基序（74.33%），其次為二核苷酸重復（13.30%）和三核苷酸重復（11.81%）。研究發(fā)現(xiàn)：多數(shù)植物中EST-SSR以二核苷酸和三核苷酸為主，但主要的重復基序類型不同［29］。推測原因可能與SSR搜索參數(shù)設置有關，多數(shù)植物在進行SSR位點搜索時并未將單核苷酸重復設置為搜索對象［13-14］。

本研究從213 058條Unigene序列中鑒定出73 896個SSR位點，豐富了黑果枸杞EST-SSR標記的數(shù)量。為了進一步評估這些EST-SSR引物的質(zhì)量，從設計到的12 674對EST-SSR引物中隨機挑選出128對引物，54對引物未能擴增出產(chǎn)物，原因可能是擴增產(chǎn)物中存在大量內(nèi)含子或引物設計不合理［30-31］；有74對引物成功擴增出產(chǎn)物，引物擴增有效性達57.8%，表明開發(fā)的引物質(zhì)量較高，對后續(xù)黑果枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標記輔助育種等均有應用價值。

圖1 4個樣本在LM-02位點的基因型Figure 1 Genotypes of 4 samples at LM-02 site

表4 28對EST-SSR引物對枸杞種質(zhì)的遺傳多樣性檢測Table 4 Genetic diversity of 24 wolfberry germplasm revealed by 28 EST-SSR markers