組蛋白去乙?；冈诳谇粊碓闯审w干細(xì)胞成骨向/成牙本向分化的研究進(jìn)展

宋 詞，陳 婷，吳補(bǔ)領(lǐng)

南方醫(yī)科大學(xué)1口腔醫(yī)學(xué)院；2南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515

表觀遺傳學(xué)包括了DNA甲基化修飾，組蛋白共價(jià)修飾，染色質(zhì)重塑，基因沉默和RNA編輯等調(diào)控機(jī)制?，F(xiàn)今，表觀遺傳學(xué)已成為一大研究熱點(diǎn)[1]。在腫瘤治療機(jī)理中，大量的抗癌藥物是通過表觀遺傳調(diào)控達(dá)到腫瘤治療的目的[2-5]。除此之外，細(xì)胞成骨能力相關(guān)表觀遺傳學(xué)的機(jī)制研究也開始逐漸被人們所重視[6]。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，口腔來源的成體干細(xì)胞相關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究，也逐漸被重視。并取得了部分成果。有研究闡述了牙髓細(xì)胞牙髓再生過程中，表觀遺傳學(xué)的調(diào)控[7]。然而，大量的深層的作用機(jī)制仍未被人們所了解。本文闡述了組蛋白去乙?；刚{(diào)節(jié)細(xì)胞成骨的研究進(jìn)展以及其在牙髓再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景。

1 組蛋白去乙?；福℉DAC）的概念與分類

Taunton等[8]首次從體內(nèi)分離并證實(shí)了第一個(gè)組蛋白去乙?；讣易宄蓡THDAC1的存在，并且認(rèn)為其與基因沉默相關(guān)。組蛋白去乙?；甘且活惖鞍酌?，對染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾起重要的調(diào)控作用，并影響基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。染色質(zhì)由核小體組成，核小體由DNA雙鏈纏繞于組蛋白八聚體組成。組蛋白去乙?；缚梢酝ㄟ^去除組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基結(jié)合的乙酰基團(tuán)，從而使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)致密卷曲，抑制基因的表達(dá)[9]。組蛋白去乙?；种苿┛梢酝ㄟ^抑制其作用使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松弛、特定區(qū)域的基因暴露，從而促進(jìn)基因的表達(dá)。隨著越來越多HDACs家族新成員的發(fā)現(xiàn)，根據(jù)結(jié)構(gòu)，組蛋白去乙?；缚煞譃?大類[10-11]，Ⅰ類：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8；Ⅱ 類 ：HDAC4、 HDAC5、 HDAC6、 HDAC7、HDAC9、HDAC10；Ⅲ類：沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT）相關(guān)酶類；Ⅳ類：HDAC11。實(shí)驗(yàn)證明，組蛋白去乙?；覆粌H僅是作用于組蛋白，也可以作用基因片段，以及非組蛋白蛋白質(zhì)[12-13]。

2 HDACs與成骨間的關(guān)系

2.1 Ⅰ類HDACs

Ⅰ類HDAC家族依其結(jié)構(gòu)與酵母Rpd3具有同源性被歸為同一類，其中包括：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8。因此，此類酶具有相似的結(jié)構(gòu)域，與基因、蛋白以及組蛋白有相似的結(jié)合位點(diǎn)。但由于其不同組蛋白去乙?；傅钠溆嘟Y(jié)構(gòu)差異，對于調(diào)節(jié)成體干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)向分化又有一定的特異性。

2.1.1 HDAC1 HDAC1與成骨向分化相關(guān)，最初其對于細(xì)胞成骨向分化的作用于2006年發(fā)現(xiàn)[14]，人原代骨髓細(xì)胞在成骨過程中，HDAC的表達(dá)水平會(huì)總體下降，其中HDAC1的表達(dá)改變尤其明顯。并且證實(shí)，HDAC1抑制后可促進(jìn)成骨相關(guān)基因sterix、骨鈣素、骨橋蛋白和堿性磷酸酶的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在C3h10t1/2細(xì)胞系骨向分化的過程中，HDAC1通過抑制RUNX2從而抑制其骨向分化[15]。HDAC1對于成骨分化的影響，與MircoRNA相關(guān)。2015年，在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)通過過表達(dá)miR-449a抑制HDAC1，可促進(jìn)RUNX2的產(chǎn)生，以促進(jìn)iPs的骨向分化[16]。說明HDAC1的產(chǎn)生，可以通過miR-449a進(jìn)行調(diào)節(jié)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，大量文獻(xiàn)證明HDAC1可調(diào)節(jié)細(xì)胞的骨向分化。部分的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣證明了HDAC1與成骨密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在婦女懷孕和哺乳期間，母體鈣會(huì)大量流失，從而導(dǎo)致母體骨量損失[17]。斷奶后，母體骨的合成水平上升。實(shí)驗(yàn)表明，其機(jī)制是通過抑制HDAC1來促進(jìn)RUNX2的轉(zhuǎn)錄活性從而促進(jìn)母體骨的形成。實(shí)驗(yàn)證明，多發(fā)性骨髓瘤的患者成骨功能不全，從而導(dǎo)致此類患者易發(fā)生骨折[18]。其機(jī)制是因?yàn)镽unx2的p1啟動(dòng)子被抑制，若抑制HDAC1的功能，可以激活Runx2的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)成骨。

2.1.2 HDAC2 HDAC2的抑制不會(huì)直接引起骨細(xì)胞的終末分化。研究發(fā)現(xiàn)在人牙髓細(xì)胞中，抑制HDAC2后，骨鈣素的水平也下降[19]。因此其實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，HDAC2會(huì)刺激未成熟的成骨細(xì)胞的產(chǎn)生，其機(jī)制尚不明確。

2.1.3 HDAC3 HDAC3對于細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)向分化過程的調(diào)控可能通過兩條途徑：（1）抑制HDAC3可促進(jìn)Runx2靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨/成牙本質(zhì)向分化。有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC3調(diào)控RUNX2介導(dǎo)的細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)成骨向分化[12]。（2）HDAC3抑制導(dǎo)致H3組蛋白上H3k9和H3k14位點(diǎn)被去乙酰化，過表達(dá)成骨相關(guān)因子，從而促進(jìn)骨向分化。有研究發(fā)現(xiàn)，在人牙周膜干細(xì)胞骨向分化時(shí)HDAC3作用于H3組蛋白，使H3k9和H3k14位點(diǎn)被去乙?；?，過表達(dá)成骨相關(guān)因子，從而促進(jìn)骨向分化[13]。

2.1.4 HDAC8 HDAC8活性抑制可以促進(jìn)細(xì)胞成骨向分化。有實(shí)驗(yàn)證明，在大鼠的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中，抑制HDAC8的活性，增強(qiáng)組蛋白H3K9乙酰化水平從而促進(jìn)成骨相關(guān)基因表達(dá)Runx2、Osterix、骨鈣素、骨橋蛋白和堿性磷酸酶，進(jìn)而促進(jìn)成骨[20]。

因此，大量實(shí)驗(yàn)表明，Ⅰ類HDACs可通過與Runx2相互作用，從而影響Runx2靶基因的表達(dá)。或者，其直接去乙酰化H3組蛋白上的特定位點(diǎn)，導(dǎo)致成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，以促進(jìn)成骨/成牙本質(zhì)向分化?？梢酝茰y，Ⅰ類HDACs具有相似的可與Runx2相結(jié)合的位點(diǎn)，從而影響細(xì)胞分化。

2.2 Ⅱ類HDACs

Ⅱ類HDAC家族依其結(jié)構(gòu)與酵母Hda1具有同源性被歸為同一類，其中包括：HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7和HDAC9。因此，此類酶也具有相似的結(jié)構(gòu)域，與基因、蛋白以及組蛋白有相似的結(jié)合位點(diǎn)。但根據(jù)其催化區(qū)域的不同，又被分為兩類：Ⅱa類具有一段催化區(qū)域，包括：HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9；Ⅱb類具有兩段催化區(qū)域，包括：HDAC6和HDAC10。目前尚無HDAC9和HDAC10對于成體干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)向分化調(diào)節(jié)相關(guān)研究，未來或可成為一研究熱點(diǎn)。而HDAC4、HDAC5、HDAC6和HDAC7相關(guān)研究也并未探明其機(jī)制。

2.2.1 HDAC4 HDAC4通過去乙?；墙M蛋白蛋白質(zhì)以及成骨相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，如Smurf-1、骨鈣素及Osx，從而影響細(xì)胞的礦化。研究表明，抑制HDAC4以抑制Runx2被降解，從而促進(jìn)BMP2的產(chǎn)生[21-22]。與Ⅰ類HDACs的作用機(jī)制不同，HDAC4未直接與Runx2相結(jié)合，而是通過影響Smurf-1以調(diào)節(jié)Runx2的降解過程。有研究在成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，HDAC4去乙?；氢}素，使骨鈣素的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而促進(jìn)細(xì)胞骨向分化[23]。實(shí)驗(yàn)表明，HDAC4作用于Osx的K307和K312位點(diǎn)，使其去乙?；瑥亩蛊浣Y(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，促進(jìn)骨向分化[13]。同時(shí)，可以促進(jìn)Osx與DNA的結(jié)合，并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。

2.2.2 HDAC5 抑制HDAC5可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，但是HDAC5在口腔來源的成體干細(xì)胞中促進(jìn)骨向分化作用的研究有限。無法直接證明在口腔來源的成體干細(xì)胞中HDAC4、5對于成骨分化的影響。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC5可以負(fù)向調(diào)節(jié)體內(nèi)和體外的骨硬化蛋白水平[24]。在小鼠的ocy454骨細(xì)胞細(xì)胞株中，HDAC5結(jié)合并抑制MEF2C（為SOST的一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá)，從而促進(jìn)礦化。

2.2.3 HDAC6 在眾多與HDAC6相關(guān)的文獻(xiàn)中，更多的是在腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用。由于HDAC6被認(rèn)為是異常蛋白降解的關(guān)鍵因子，因此，研究者多集中在其腫瘤治療用藥方面。然而，也有研究表明HDAC6與Runx2的啟動(dòng)子可以結(jié)合以調(diào)節(jié)成骨向分化進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)HDAC6特異性地和RUNX2的羧基末端相結(jié)合，從而使RUNX2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到染色質(zhì)[25]。在分化成骨細(xì)胞和前成骨細(xì)胞的過程中，Runx2的p21啟動(dòng)子表達(dá)被HDAC6抑制，從而導(dǎo)致成骨細(xì)胞的早期分化啟動(dòng)子受到抑制。

2.2.4 HDAC7 HDAC7被認(rèn)為可能是成骨時(shí)間以及成骨細(xì)胞成熟率的重要調(diào)節(jié)因子。有研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12細(xì)胞系中，HDAC7和RUNX2結(jié)合并抑制RUNX2的活性[26]。并且用RNA抑制劑沉默HDAC7后，會(huì)加速依賴BMP2的成骨分化過程。

2.3 Ⅲ類和Ⅳ類HDACs

目前為止，Ⅲ類HDACs與骨向分化的關(guān)系之間的研究較少，大多部分研究著眼于SIRT。有研究認(rèn)為，SIRT通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（重要的脂向分化調(diào)控因子），從而抑制細(xì)胞的脂向分化，間接促進(jìn)細(xì)胞的骨向分化[27]。研究證明，SIRT是牙周膜細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，抑制SIRT可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的分化[28]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在小鼠胚胎干細(xì)胞中，胰島素和SIRT1共同作用于細(xì)胞，可以增加其成骨分化效率[29-30]。Ⅳ類HDACs，HDAC11組蛋白去乙?；讣易逯凶饔米顬樘厥獾囊粋€(gè)，其作用被認(rèn)為更多的是與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及定位相關(guān)，其在骨向分化過程中的作用不明。

3 HDACi對于細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)向分化的作用

HADC的抑制大多是通過HDACi實(shí)現(xiàn)的，然而，大部分的HDACi并不會(huì)特異性地抑制某一種HADC，而是抑制某一類或幾類的HDACs。因此，不同的HDACi具有其特殊的作用。HDACi已在臨床中作為抗腫瘤的藥物廣泛應(yīng)用。在牙源性的成體干細(xì)胞中，HDACi也可作為藥物直接使用。有研究認(rèn)為組蛋白去乙酰化酶抑制劑和DNA甲基化抑制劑可作用于牙髓細(xì)胞并可應(yīng)用于未來牙髓再生治療[31-32]。

3.1 TSA（HDACⅠ、Ⅱ、Ⅳ類抑制劑）的成骨作用

TSA可以促進(jìn)細(xì)胞的成骨向分化。研究表明，TSA促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生堿性磷酸酶，加速基質(zhì)礦化和成骨細(xì)胞的基因表達(dá)[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中TSA可增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的早期成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶活性，以及成骨標(biāo)志物骨橋蛋白、骨鈣素和基質(zhì)的礦化，證明HDAC抑制劑可以促進(jìn)骨向分化[34]。骨髓間充質(zhì)細(xì)胞是間充質(zhì)來源的一類成體干細(xì)胞，口腔來源的成體干細(xì)胞也來源于間充質(zhì)。因此，兩者具有某些相同的生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)證明，TSA促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)向分化并會(huì)加強(qiáng)其增殖能力，在體外具有增強(qiáng)牙齒發(fā)育過程中牙本質(zhì)形成和體內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化的能力[35]。此外，TSA注射于胚胎表現(xiàn)出牙本質(zhì)厚度增加以在免疫組化染色可見出生后磨牙牙本質(zhì)細(xì)胞中，牙本質(zhì)涎蛋白表達(dá)染色增強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)，TSA會(huì)促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的骨向分化，同時(shí)不影響細(xì)胞的存活以及活性。其實(shí)驗(yàn)同時(shí)說明，在人牙周膜細(xì)胞的骨向分化過程中組蛋白H3的乙酰化水平增加，而HDACi作用于H3以促進(jìn)骨向分化。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了牙周膜細(xì)胞作為種子細(xì)胞可被TSA刺激促進(jìn)成骨，應(yīng)用于牙再生治療的可能性。

3.2 SAHA（HDAC1和HDAC3的抑制劑）骨向分化的作用

SAHA同樣可以促進(jìn)細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)向分化。有研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12細(xì)胞系以及HEK-293T細(xì)胞系骨向分化過程中，SAHA通過去乙?；疪unx2使其結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，從而增加Runx2的轉(zhuǎn)錄活性，并通過BMP-2來增強(qiáng)堿性磷酸酶的活性[21]。有實(shí)驗(yàn)證明了短期、低劑量的在成骨誘導(dǎo)過程中加入SAHA可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶通路以及組織蛋白酶來促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的骨向分化[36-37]。SAHA可以促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)礦化相關(guān)標(biāo)記物的產(chǎn)生。

3.3 VPA（HDACs抑制劑）骨向分化的作用

低濃度VPA不影響細(xì)胞活力，同時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞分化。有研究觀察到，在小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中VPA會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化[38]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在人牙髓干細(xì)胞中，低濃度的VPA不影響細(xì)胞活力，增殖和細(xì)胞周期的分布[19]。同時(shí)，可以顯著增強(qiáng)基質(zhì)礦化水平，并促進(jìn)骨橋蛋白和骨涎蛋白的表達(dá)。

4 結(jié)論

HDACs在牙再生組織工程學(xué)中的應(yīng)用前景。對牙齒發(fā)生發(fā)育和口腔疾病發(fā)生發(fā)展，具有重大的影響。在發(fā)現(xiàn)HADC后的20年里，大量的研究關(guān)注熱點(diǎn)在抗腫瘤的藥物應(yīng)用之中。近幾年，HDAC對于細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用以及其抑制劑對于促進(jìn)組織再生的作用才開始受到重視。大量的研究結(jié)果表明HDAC具有應(yīng)用于口腔再生醫(yī)學(xué)的巨大潛力。