應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)檢測(cè)胎兒染色體6p25缺失綜合征

羅曉輝 曾玉坤 胡蓉 蘭菲菲

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511440)

6p25缺失綜合征(6p25 deletion syndrome)是一種罕見(jiàn)的染色體微缺失綜合征，主要包含F(xiàn)OXC1、FOXF2等致病基因，6p25缺失綜合征表型涉及多系統(tǒng)，表型可為有腦畸形、先天性心臟異常、發(fā)育遲緩、眼前段異常、聽(tīng)力喪失等[1]。染色體拷貝數(shù)變異是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的關(guān)鍵因素，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于6p25缺失綜合征的產(chǎn)前診斷報(bào)道較少，本文結(jié)合單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism microarray，SNP-array)檢測(cè)技術(shù)診斷6p25缺失綜合征并進(jìn)行文獻(xiàn)回顧，以提高對(duì)該疾病臨床表型及致病基因的認(rèn)識(shí)。

1 資料與方法

1.1 基本資料 試驗(yàn)樣本來(lái)自廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心遺傳咨詢(xún)門(mén)診患者夫婦，女方為妊娠狀態(tài)，孕23周，因超聲發(fā)現(xiàn)NT增厚，胎兒腦部發(fā)育異常進(jìn)行遺傳咨詢(xún)。孕期無(wú)不良接觸史，夫妻雙方非近親結(jié)婚，否認(rèn)不良生育史和家族遺傳病史。

1.2 研究方法

1.2.1 胎兒樣本采集 經(jīng)孕婦和家屬同意，簽署知情同意書(shū)后在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)抽取胎兒羊水20 ml，其中15 ml用于染色體核型分析，5 ml保存于4℃冰箱用于SNP-array檢測(cè)。

1.2.2 基因組DNA提取 羊水5ml用2000轉(zhuǎn)/分離心10min，棄上清留取羊水細(xì)胞，使用Qiamp DNA Blood Mini Kit提取試劑盒(Qiagen公司，德國(guó))提取基因組DNA，按照試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取操作。

1.2.3 單核苷酸多態(tài)性微陣列檢測(cè) 利用SNP-array檢測(cè)平臺(tái)，使用Affymetrix公司的Cytoscan750k芯片，按照操作手冊(cè)流程，羊水DNA經(jīng)過(guò)酶切、連接、擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、片段化、標(biāo)記、雜交、洗滌、掃描后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)分析過(guò)程分別參照本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)以及國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)分析CNV的致病性，包括DECIPHER、基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)(Database of Genomic Variants，DGV)、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、UCSC基因組瀏覽器，結(jié)果分為致病性CNV、可能致病CNV、臨床意義不明CNV、可能良性CNV、良性CNV。

1.2.4 羊水染色體核型分析 羊水樣本15 ml在無(wú)菌條件下按照G顯帶染色體核型分析標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行接種、培養(yǎng)、收獲、G顯帶及核型分析。

2 結(jié)果

SNP-array檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)胎兒基因組在6號(hào)染色體短臂6p25.3-p25.2區(qū)域存在缺失，具體為arr[hg19]6p25.3p25.2(384、096-3、136,073)×1,缺失片段大小約為2.7Mb，該缺失區(qū)域涉及FOXC1、FOXF2、DUSP22、IRF4、EXOC2等15個(gè)OMIM基因(圖1)。羊水染色體核型結(jié)果提示為46，XN，未見(jiàn)明顯異常。

圖1 胎兒羊水SNP-array檢測(cè)結(jié)果(紅色代表缺失)

3 討論

染色體拷貝數(shù)變異時(shí)引起產(chǎn)前胎兒發(fā)育異常的常見(jiàn)病因，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展極大提高了胎兒染色體小片段拷貝數(shù)變異疾病檢出率[2]。本病例胎兒出現(xiàn)腦中線發(fā)育異常，腦室增寬等顱腦發(fā)育異常的聲像，SNP-array檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6p25.3-p25.2區(qū)域發(fā)生2.7Mb缺失，該區(qū)域包含F(xiàn)OXC1、FOXF2等15個(gè)OMIM基因，應(yīng)用疾病數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析發(fā)現(xiàn)該片段區(qū)域功能性基因的缺失可導(dǎo)致患者出現(xiàn)6p25缺失綜合征，檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)FOXC1為該綜合征的主要致病基因。6p25缺失綜合征臨床表型涉及多系統(tǒng)多器官，其臨產(chǎn)表型有腦畸形、先天性心臟異常、發(fā)育遲緩、眼前段異常、聽(tīng)力喪失等[3]。

檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)， 6p25缺失綜合征中有83%(49/59)存在Axenfeld-Rieger綜合征，大約一半人患有青光眼，約24%患者有視網(wǎng)膜異常，主要為色素改變[4]。幾乎所有6p25缺失綜合征患者都存在先天性面部畸形，典型的面部特征包括眼距過(guò)寬(93%)、下斜瞼裂(69%)、中面部發(fā)育不全(77%)、前額突出(51%)、小頜(21%)和張口(48%)、牙齒異常(44%)，少數(shù)表現(xiàn)為小頭畸形[4]。在6p25缺失綜合征病例中，各種骨骼異常均有報(bào)道，臨床表型以短頸(36%)、手足異常(65%)最為常見(jiàn)，口腔牙齒異常見(jiàn)于少部分患者。少數(shù)病例有身材矮小(31%)和脊柱側(cè)彎(17%)。室間隔缺損、房間隔缺損、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、心臟流出到道異常等心臟畸形見(jiàn)于約60%的6p25缺失綜合征患者[4，5]。據(jù)報(bào)道6p25缺失患者的腦畸形包括腦積水(39%)、腦室擴(kuò)張、部分胼胝體發(fā)育不全等[4-6]。6p25小片段缺失與枕大池和小腦蚓部發(fā)育不良有關(guān)。包含F(xiàn)OXC1和GMDS等基因在內(nèi)的大片段缺失，則與典型的Dandy-Walker畸形有關(guān)，推測(cè)可能原因?yàn)镕OXC1上游染色體重排會(huì)引起相關(guān)調(diào)控元件的丟失導(dǎo)致基因表達(dá)減少而致病。另外80%的6p25缺失綜合征患者有生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和智力障礙[4-7]。

FOXC1基因(OMIM 601090)屬于轉(zhuǎn)錄因子家族基因，編碼胚胎多種組織的叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子。定位于6p25，全長(zhǎng)3452bp，含一個(gè)外顯子[8]。FOXC1主要表達(dá)于中胚層的生殖嵴、腸系膜處。FOXC1基因是一種對(duì)眼的前房發(fā)育呈劑量敏感效應(yīng)的基因，F(xiàn)OXC1基因單倍劑量的不足與患者眼前段發(fā)育異常的表型有關(guān)。小鼠眼組織中，F(xiàn)OXC1主要表達(dá)于小鼠眼間質(zhì)組織和眼周?chē)g質(zhì)組織，其缺失復(fù)制均能導(dǎo)致ASD[9]。FOXC1基因純合缺失小鼠在出生前便可因出血性腦水腫，嚴(yán)重骨骼、心臟、眼部發(fā)育異常而死亡，而雜合缺失的小鼠表現(xiàn)為眼前段發(fā)育不良，該表型與人類(lèi)表型一致[4,10]。

FOXC1缺失、重復(fù)、突變與Axenfeld-Rieger綜合征密切相關(guān)，其發(fā)病率為1/200 000，以常染色體顯性或者隱性遺傳，少部分為散發(fā)病例，完全外顯率，具有遺傳異質(zhì)性，其主要臨床癥狀為眼前段、顱面部、牙齒等發(fā)育異常，約半數(shù)患者會(huì)進(jìn)展為青光眼，部分患者伴隨心臟缺陷、尿道下裂、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和智力低下等癥狀[11,12]。

本文發(fā)現(xiàn)的胎兒存在染色體6p25.3-p25.2區(qū)域缺失，超聲結(jié)果顯示胎兒腦中線發(fā)育異常，腦室增寬等顱腦發(fā)育異常的聲像，出現(xiàn)6p25缺失綜合征的表型，而染色體核型分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)異常。

高分辨率的SNP-array技術(shù)近些年在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用較多，與染色體核型分析相比，SNP-array技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)染色體的微缺失或者微重復(fù)，對(duì)于嚴(yán)重發(fā)育畸形的染色體微缺失綜合征的診斷有重要意義。因此，超聲發(fā)現(xiàn)有發(fā)育異常的胎兒應(yīng)建議進(jìn)行SNP-array檢測(cè)，并檢測(cè)胎兒父母，結(jié)合超聲監(jiān)測(cè)結(jié)果綜合分析，避免因染色體核型分析分辨率不足導(dǎo)致的漏診，同時(shí)可以找到一些由于微缺失綜合征導(dǎo)致胎兒發(fā)病的原因。