變換波長HPLC法同時測定藥食同源降脂片中橙黃決明素、蘆丁和槲皮素含量

陳靜 丁潔 沙芮 李瑞賓 牛犇

摘要：采用Gemini C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速為1 mL/min，柱溫40 ℃，波長切換（0～20 min，在370 nm波長下檢測蘆丁，20～30 min，在280 nm波長下檢測槲皮素和橙黃決明素），進樣量20 μL，流動相為甲醇（A）-水（B）。結(jié)果表明，橙黃決明素在1.977 2～98.860 0 μg/mL（R2=0.999 7）線性關(guān)系良好，平均回收率為98.81%，RSD為2.0 %;蘆丁在1.958 0～97.900 0 μg/mL（R2=0.999 6）線性關(guān)系良好，平均回收率為98.16%，RSD為2.2%;槲皮素在2.283 6～114.18 μg/mL（R2=0.999 6）線性關(guān)系良好，平均回收率為100.44%，RSD為3.0%。藥食同源降脂片中橙黃決明素平均含量0.053 2 mg/g，RSD為1.36%;蘆丁平均含量0.847 0 mg/g，RSD為0.65%;槲皮素平均含量0.040 9 mg/g，RSD為0.80%。該方法操作簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于藥食同源降脂片的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）;橙黃決明素;蘆丁;槲皮素;藥食同源降脂片

中圖分類號：S132? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）02-0111-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.025? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

據(jù)2017年中國新近公布的流行病學(xué)資料顯示，全國血脂異常的患病率為18.6%，現(xiàn)有患者1.6億人，研究開發(fā)新型純天然中藥降脂類藥物及保健品十分重要。目前臨床上廣泛應(yīng)用他汀類藥物來治療高血脂癥并預(yù)防心腦血管病癥意外發(fā)生，療效較顯著。但長期或大劑量使用他汀類藥物可能會導(dǎo)致心臟橫肌紋溶解、肝臟組織細(xì)胞生物化學(xué)變化等嚴(yán)重不良反應(yīng)[1，2]。

本研究所用的藥食同源降脂片是由山楂（去核）、決明子、洋蔥、黃瓜和枸杞等純天然物質(zhì)經(jīng)過粉碎、提取、濃縮、干燥、打粉、壓片而制得，具有降血脂、活血通經(jīng)、益精血等作用。其中，決明子中的橙黃決明素[3，4]、山楂中的三萜酸和黃酮[5-8]、枸杞中的多糖和木耳多糖、洋蔥中的蒜氨酸酶[9]等均對降低血脂有顯著功效。且有研究表明，決明子和山楂配合在一起有較好的降血脂作用[10]。

決明子為臨床常用中藥，是國家衛(wèi)生部公布的既是食品又是藥品的中藥材，臨床應(yīng)用表明其降脂作用明確[11]，療效可靠、副作用少，但與其他傳統(tǒng)中藥一樣，存在著成分復(fù)雜、機理不十分清楚等缺點。據(jù)近年來的研究報道，決明子中的專屬成分橙黃決明素能顯著增強LDLR基因轉(zhuǎn)錄水平，為決明子中有效降脂成分，已有基于GC-MS的代謝組學(xué)研究了橙黃決明素治療高血脂癥大鼠血漿中代謝物的變化，多元統(tǒng)計分析證實了橙黃決明素可以較好地調(diào)節(jié)高血脂癥大鼠血脂水平。橙黃決明素作用于氨基酸及脂肪酸的代謝通路，能夠達(dá)到較好的調(diào)脂作用。

山楂是一種常用中藥，味酸、甘，性微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有消食健胃、行氣散疲功能，用于肉食積滯，胃脘脹滿，瀉痢腹痛，疲血經(jīng)閉，產(chǎn)后疲阻，心腹刺痛，病氣疼痛、高脂血癥等。近年來，更廣泛用于治療心血管疾病和抗菌消炎，引起國內(nèi)外學(xué)者的注意和重視。山楂降壓、增加冠脈血流量、降低血脂、耐缺氧、強心、抗心率不齊的有效成分為黃酮類化合物，其主要成分為蘆丁、金絲桃普、槲皮素等，而黃酮類化合物的藥理研究也顯示降血脂作用[12]。故本研究選擇橙黃決明素、蘆丁和槲皮素作為藥食同源降脂片的質(zhì)量評價指標(biāo)，建立了HPLC法同時測定藥食同源降脂片中的橙黃決明素、蘆丁和槲皮素含量，為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

橙黃決明素對照品（52850010）、蘆丁對照品（E2260050）、槲皮素對照品（E3680050）購于上海安譜實驗科技股份有限公司（純度均>98%）;藥食同源降脂片（甘肅省商業(yè)科技研究所，批號2017010606）;甲醇為色譜純（Amethyst Chemicals，LCB0M02），水為去離子水，其他試劑均為色譜純。

1.2? 試驗儀器

UPT-I-20L型落地式純水機（四川優(yōu)普超純科技）;XS225A型電子分析天平（普利塞斯，瑞士）;LC-20A型高效液相色譜儀（島津）。

1.3? 方法

1.3.1? 工藝流程? 原料→分揀→粉碎→提取→過濾→濃縮→噴霧干燥→干粉→輔料配比→混合→濕法制?！稍铩！偦臁鷫浩b→成品。

1.3.2? 溶液配制

1）對照品溶液。分別精密稱取橙黃決明素、蘆丁和槲皮素對照品0.004 95、0.004 93和0.005 82 g，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容成含橙黃決明素0.494 3 mg/mL，蘆丁0.489 5 mg/mL，槲皮素0.570 9 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液溶液。

2）供試品溶液。取藥食同源降脂片20片，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉1 g，置10 mL量瓶中，加入淀粉酶溶液1 mL，調(diào)節(jié)pH在4～5。將樣品溶液在室溫下放置7～8 h，使藥片中淀粉水解，加入純甲醇溶液加熱回流4 h，冷卻后揮干溶劑，用甲醇定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液為供試品溶液。

1.3.3? 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗? 色譜條件：Gemini C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量20 μL。檢測波長為0～20 min，370 nm;20～30 min，280 nm。流動相為水（A）∶甲醇（B）=70∶30。橙黃決明素、蘆丁、槲皮素色譜峰分離良好。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 線性試驗

分別精密吸取橙黃決明素、蘆丁、槲皮素混合對照品溶液，稀釋至濃度為2、10、50、80、100 μg/mL。以進樣量（μg）對峰面積（A）進行線性回歸，得橙黃決明素、蘆丁、槲皮素回歸方程見表1，表明橙黃決明素在1.977 2～98.860 0 μg/mL線性關(guān)系良好，蘆丁在1.958 0～97.900 0 μg/mL線性關(guān)系良好，槲皮素在2.283 6～114.180 0 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.2? 精密度試驗

分別吸取橙黃決明素、蘆丁、槲皮素儲備液各10 μL，用甲醇定容至1 mL，連續(xù)進樣6次，計算橙黃決明素、蘆丁和槲皮素峰面積的RSD分別為0.53%、0.64%和0.52%，表明精密度良好。

2.3? 重復(fù)性試驗

取同一批藥食同源降脂片，按“1.3.2”方法制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進樣測定，結(jié)果顯示橙黃決明素、蘆丁、槲皮素平均含量為0.053 2、0.847 0和0.040 9 mg/g，RSD分別為1.36%、0.65%和0.80%。

2.4? 穩(wěn)定性試驗

精密稱取樣品細(xì)粉1 g，按“1.3.2”方法制供試品溶液，分別于配制后0、2、8、16和24 h各進樣20 μL，得橙黃決明素、蘆丁和槲皮素色譜峰峰面積的RSD分別為1.24%、0.79%和1.46%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5? 加樣回收試驗

取己知各成分含量的藥食同源降脂片20片（橙黃決明素含量0.053 2 mg/mL，蘆丁含量0.847 0 mg/mL，槲皮素含量0.040 9 mg/mL），研細(xì)后精密稱取細(xì)粉0.5 g，共6份（相當(dāng)于含橙黃決明素0.026 6 mg、蘆丁0.423 5 mg、槲皮素0.020 4 mg），至10 mL容量瓶中，加入橙黃決明素對照品溶液54 μL（質(zhì)量濃度0.494 3 mg/mL）、蘆丁對照品溶液865 μL（質(zhì)量濃度0.489 5 mg/mL）、槲皮素對照品溶液36 μL（質(zhì)量濃度0.570 9 mg/mL），按“1.3.2”條件配制，進樣測定，結(jié)果見表2。

2.6? 樣品含量測定

取3瓶樣品，每瓶藥品隨機取3組藥片，按“1.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果見表3。藥片中橙黃決明素平均含量0.053 2 mg/g，RSD為1.36%;蘆丁平均含量0.847 0 mg/g，RSD為0.65%;槲皮素平均含量0.040 9 mg/g，RSD為0.80%。

3? 討論

關(guān)于高效液相色譜法同時測定蘆丁和槲皮素含量的文獻[13-15]較多，測定決明子中橙黃決明素含量的文獻[16-18]也不少，但同時測定橙黃決明素、蘆丁和槲皮素的方法尚未見報道，本研究通過多次嘗試，根據(jù)3種物質(zhì)的最大吸收波長，最終確定了通過變換波長法同時測定以上3種物質(zhì)的高效液相色譜條件。關(guān)于流動相的選擇問題，其他報道中測定以上3種成分的流動相多為甲醇、磷酸水及乙腈，本研究嘗試采用甲醇和水作為流動相，仍然可取得較好的分離效果，達(dá)到了更加安全環(huán)保的成效，并可減少化學(xué)溶劑的使用。

4? 結(jié)論

本試驗建立了高效液相色譜法同時測定藥食同源降脂片中橙黃決明素、蘆丁和槲皮素含量的方法。結(jié)果表明，流動相為水（A）∶甲醇（B）=70∶30的條件下，橙黃決明素、蘆丁和槲皮素可以較好得分離。該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性強，經(jīng)測定藥食同源降脂片中橙黃決明素平均含量0.053 2 mg/g，RSD為1.36%;蘆丁平均含量0.847 0 mg/g，RSD為0.65%;槲皮素平均含量0.040 9 mg/g，RSD為0.80%，為藥食同源降脂片的質(zhì)控提供了依據(jù)。

參考文獻：

[1] 馬杭琨，徐鳳芹.中藥降脂機制及其有效降脂成分的研究進展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016（13）：1494-1497.

[2] 林嘉成，岑柏宏，江維寧，等.降脂中藥活性成分研究進展[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2013（12）：164.

[3] 余? 勝，鄧? 楠，劉? 文，等.基于代謝組學(xué)研究橙黃決明素對高脂血癥大鼠的調(diào)脂作用[J].分析科學(xué)學(xué)報，2016，32（2）：178-182.

[4] 戴迎春.決明子中橙黃決明素的提取分離純化及在正常大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)研究[D].長沙：湖南師范大學(xué)，2011.

[5] 劉北林，董繼生，倪小虎，等.山楂黃酮提取及降血脂研究[J].食品科學(xué)，2007，28（5）：324-327.

[6] 肖? 婷.山楂對高血脂大鼠模型血脂水平的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，27（13）：1927-1928.

[7] 王? 玲，吳軍林，吳清平，等.山楂降血脂作用和機理研究進展[J].食品科學(xué)，2015，36（15）：245-248.

[8] 林? 科，張?zhí)?，張鶴云.山楂中熊果酸的提取及其對小鼠的降血脂作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19（6）：1052-1054.

[9] 易傳祝，陳煒林，周月嬋.洋蔥提取物降血脂動物實驗研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2010，10（5）：575-577.

[10] 綦振峰，李官浩，鄭昌吉，等.山楂、決明子及其配伍的降血脂作用[J].食品與機械，2013（2）：96-99.

[11] 戴迎春，鄧? 楠，劉? 文.橙黃決明素在正常大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（14）：1271-1274.

[12] 高? 瑩，肖? 穎.山楂及山楂黃酮提取物調(diào)節(jié)大鼠血脂的效果研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2002，14（3）：14-16.

[13] 暴鳳偉，劉玉強，張振秋，等.HPLC法測定山楂提取物中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（2）：246-248.

[14] 張慧月，耿? 暉，董? 瓊，等.HPLC法同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，18（1）：64-66.

[15] 支? 國.山楂中主要成分HPLC測定方法的研究[D].河北秦皇島：河北科技師范學(xué)院，2013.

[16] 王云霞，張? 鑫.變換波長HPLC同時測定決明子中橙黃決明素和大黃酚的含量[J].陜西中醫(yī)，2016（8）：1080-1081.

[17] 梅國榮，劉? 飛，王? 福，等.一測多評法測定決明子中橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚[J].中草藥，2016（8）：1392-1396.

[18] ZHU L，YU S，ZENG X，et al. Preparative separation and purification of five anthraquinones from Cassia tora L. by high-speed counter-current chromatography[J].Separation and Purification Technology，2008，63（3）：665-669.