香港地區(qū)漢族人群下頜前突與候選基因GHR多態(tài)性關(guān)聯(lián)研究

薛 凡，陳 紅

0 引 言

下頜前突是一種常見的牙頜面畸形，臨床特征為向前突出的下頜和前牙的反合，在各種族人群中的發(fā)病率不同，其中以東亞裔人群中的發(fā)病率較高，約為 15%［1?3］。近 50% 的患者需接受包括正頜外科手術(shù)等不同的矯正治療，以獲得正常的咬合關(guān)系及面部容貌的改善。研究表明，遺傳因素和各種環(huán)境因子相互作用于處于生長發(fā)育期的下頜骨髁狀突軟骨是造成下頜骨前突的主要原因［5］。近年來的家族和雙胞胎研究也表明，遺傳因素在下頜骨前突的發(fā)生中占有重要作用，下頜骨前突是一種具有多基因遺傳模式的復(fù)雜疾?。??6］。

目前國內(nèi)外對(duì)下頜骨前突易感基因定位的研究主要集中在連鎖分析研究。染色體位點(diǎn)1p22?p36和12q13?q24被認(rèn)為是最有可能包含有下頜前突易感基因的位點(diǎn)［7?10］。關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)位于1p22?p36位點(diǎn)內(nèi)與下頜前突陽性關(guān)聯(lián)的基因有EPB41、MATN1、SSX2IP和PLXNA［9，11?12］。此外也有研究發(fā)現(xiàn)，位于12q13?q24位點(diǎn)內(nèi)的陽性關(guān)聯(lián)基因有COL2A1、MYO1H、TGFB3 和LTBP2［10，13?15］。除了以上位點(diǎn)內(nèi)根據(jù)生物學(xué)功能與軟骨及骨生長和顱面發(fā)育等相關(guān)的候選基因，研究表明GHR基因?qū)︼B頜面骨的生長發(fā)育有重要的影響，但GHR與下頜前突的關(guān)聯(lián)仍不能明確［16?21］。本研究對(duì) 211 例下頜前突病例和224例對(duì)照的GHR基因進(jìn)行SNP基因分型，通過對(duì)SNP及其單倍型分析，鑒定與下頜前突關(guān)聯(lián)的易感基因。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2006年9月至2009年6月期間香港大學(xué)牙醫(yī)學(xué)院菲臘牙科醫(yī)院登記注冊(cè)患者。包括下頜前突患者211例（下頜前突組），其中男108例、女103例；對(duì)照組均為咬合關(guān)系與面形正?；颊撸╪=224），其中男115例、女109例。納入標(biāo)準(zhǔn)：I類錯(cuò)牙合的上下頜第一磨牙呈關(guān)系中性，0°＜ANB角＜5°；下頜前突的基本臨床特征評(píng)估包括是否存在前牙反牙合（10，16）。下頜前突最終診斷標(biāo)準(zhǔn)基于頭影測量關(guān)鍵參數(shù)ANB角 ＜?2°（17，18）。排除唇腭裂患者。所有研究對(duì)象均為現(xiàn)居住在香港的漢族居民。本研究經(jīng)香港大學(xué)及醫(yī)管局港島西醫(yī)院聯(lián)網(wǎng)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：UW07?102），所有調(diào)查取樣均經(jīng)受試者同意并簽署知情同意書。

1.2 SNPs選擇和基因分型通過HapMap和NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）選擇SNPs。僅選擇中國漢族人群中具有最小等位基因頻率（mi?nor allele frequency，MAF）至少 10% 的 SNPs。選擇7個(gè)位于GHR基因的tSNPs進(jìn)行基因分型。抽取受試者外周血1～2 mL，用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA?K）抗凝，使用Omega Bio?Tek DNA提取試劑盒提法提取全基因組DNA（Doraville，GA，USA），紫外分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和純度，置于?20℃保存?zhèn)溆?。所有DNA樣本按照要求在96孔板上稀釋及排列并被送到指定地點(diǎn)（香港大學(xué)基因組研究中心），在Sequenom MassArray平臺(tái)（San Diego，CA，USA）上對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行SNPs基因分型。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的人類基因組序列，選取每個(gè)SNP兩側(cè)的側(cè)翼序列（250～300 bp）用于設(shè)計(jì)PCR引物。每個(gè)SNP基因分型檢出率＞98%，重復(fù)校驗(yàn)的成功率＞99.5%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析群體基因型頻率經(jīng)Hardy?Wein?berg平衡檢驗(yàn)（www.oege.org/software），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01，P＞0.01被認(rèn)為為符合Hardy?Weinberg遺傳平衡。采用卡方檢驗(yàn)對(duì)每個(gè)SNP基因型分布和等位基因頻率進(jìn)行組間比較，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。等位基因關(guān)聯(lián)強(qiáng)度以比值比（OR）表示。對(duì)每一對(duì)SNPs進(jìn)行連鎖不平衡評(píng)估，并通過Haplo?view 4.1軟件進(jìn)行單倍型分析（Broad Institute，Cam?bridge，MA，USA）。

2 結(jié) 果

2.1 SNPs關(guān)聯(lián)分析 所有7個(gè)tSNPs分別檢驗(yàn)后均符合Hardy?Weinberg平衡定律，每個(gè)SNP等位基因的MAF符合NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫的信息。GHR基因中7個(gè)tSNPs的選擇和基因分型見表1。SNP rs6898743與下頜前突的關(guān)聯(lián)分析顯示2組間基因型和等位基因頻率有顯著性差異（P=0.036、P=0.015）；下頜前突組rs6898743等位基因G頻率較對(duì)照組減少，具有顯著性減低下頜前突的風(fēng)險(xiǎn)（OR=0.72、95%CI 0.55～0.94），見表2。

表1 SNPs選擇和基因分型Table 1 Selection and genotyping of the SNPs of the GHR gene

表2 GHR基因SNP位點(diǎn)rs6898743的關(guān)聯(lián)分析Table 2 Results of the association analysis on the SNP locus rs6898743 of the GHR gene

2.2 連鎖不平衡與單倍型分析GHR基因中的7個(gè)tSNPs形成1個(gè)連鎖不平衡區(qū)塊，共構(gòu)建了6個(gè)單倍型。連鎖不平衡分析顯示兩組間比較單倍型GAA和GAG有顯著性差異（P=0.014、P=0.012）。見圖1。

圖1 GHR基因的連鎖不平衡和單倍型區(qū)塊Figure 1 Linkage disequilibrium and haplotype blocks of the GHR gene

3 討 論

GHR是生長激素發(fā)揮作用的生理基礎(chǔ)。生長激素必須與靶細(xì)胞表面的GHR結(jié)合，誘導(dǎo)GHR分子同源二聚化，然后激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)傳導(dǎo)。近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，GHR基因的多態(tài)性可能導(dǎo)致GHR在不同個(gè)體中的表達(dá)水平或功能上的差異，進(jìn)而影響生長激素生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮，其突變的位點(diǎn)多導(dǎo)致GHR細(xì)胞外區(qū)功能缺陷，也可引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，導(dǎo)致IGF?1的分泌變化，主要影響軟骨的生長，造成生長發(fā)育障礙，以及對(duì)某些疾病的易感性。GHR基因定位于第5號(hào)染色體近端短臂上p12～p13.1，是一個(gè)由單一基因編碼含620個(gè)氨基酸的跨膜糖蛋白，是促乳素/生長激素/細(xì)胞因子/促紅細(xì)胞生成素受體超家族成員之一。

近年來一些研究發(fā)現(xiàn)GHR基因多態(tài)性與下頜發(fā)育生長有顯著性關(guān)聯(lián)［16?17］，分別有中國、日本和韓國研究結(jié)果表明GHR基因多態(tài)性與東亞人群下頜高度有相關(guān)性，其中日本學(xué)者的研究首先報(bào)道正常日本人口中GHR基因P56IT多態(tài)性影響下頜支長度；對(duì)中國人群的研究表明GHR基因I526L多態(tài)性與正常個(gè)體的下頜支長度有關(guān)［18］；而韓國研究則并不支持GHR基因I526L多態(tài)性與正常個(gè)體的下頜支長度有關(guān)，其研究顯示有效的下頜長度和下面部高度與SNP位點(diǎn)P561T變異有關(guān)［19］。Bayram等［20］研究顯示GHR可能是下頜前突群體下頜骨形態(tài)發(fā)生的候選基因，同樣顯示有效的下頜長度和下面部高度與SNP位點(diǎn)P561T變異有關(guān)。此外，有研究顯示GHR基因中SNP位點(diǎn)P561T的雜合錯(cuò)義突變?cè)趦和瘯r(shí)期影響其下頜骨的生長發(fā)育［21］。

然而，以上研究并沒有直接證據(jù)表明GHR基因多態(tài)性與下頜前突的關(guān)聯(lián)性。本研究通過香港地區(qū)435例病例對(duì)照人群發(fā)現(xiàn)GHR基因中SNP rs6898743與下頜前突存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。SNP關(guān)聯(lián)分析顯示SNP rs6898743的基因型和等位基因頻率兩組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析結(jié)果表明，GHR基因多態(tài)性與中國人群下頜前突有陽性關(guān)聯(lián)。連鎖不平衡分析顯示7個(gè)tSNPs在GHR基因中形成1個(gè)單倍型區(qū)塊，單倍型GAA和GAG在下頜前突組和對(duì)照組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究只選擇一組平均分布于GHR基因中的7個(gè)tSNPs，均位于內(nèi)含子，關(guān)聯(lián)分析仍需調(diào)查更多的SNPs，進(jìn)一步對(duì)GHR基因內(nèi)的tSNPs進(jìn)行基因分型才能明確與下頜前突的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)。

本研究通過對(duì)下頜前突的候選基因GHR進(jìn)行評(píng)估，候選基因的選擇是基于其生物學(xué)功能和遺傳學(xué)研究證據(jù)，提出GHR基因可能是一個(gè)新的可用于研究中國漢族人群下頜前突遺傳危險(xiǎn)因素的易感基因。鑒于各種被研究人群的數(shù)量和結(jié)果差異性較大，關(guān)于GHR基因多態(tài)性是否與下頜前突存在關(guān)聯(lián)性的仍需不同種族人群的重復(fù)性研究，下頜前突的遺傳病因?qū)W仍有待進(jìn)一步研究。