程序性細胞死亡配體1狀態(tài)與乳腺癌放療敏感性的關(guān)系

滿忠松，湯在祥，周 進，趙 鑫，張海濤

0 引 言

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥死亡的主要原因。放療在降低乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)和改善臨床預(yù)后中起重要作用。近年來隨著放療學(xué)的發(fā)展和技術(shù)改進，放療患者總體生存率得到明顯改善。但由于腫瘤在分子基因水平上存在高度異質(zhì)性，對于同一臨床病理特征且接受相同放療方案的患者，放療效果卻存在差異［1］。因此，在基因組水平上探索放射敏感性標記物，發(fā)現(xiàn)放療受益患者引起學(xué)者廣泛關(guān)注。

免疫療法是一種實體癌癥治療措施，其主要方式是阻斷PD?1/PD?L1信號通路，從而提高T細胞對腫瘤的反應(yīng)［2］。針對靶向PD?1/PD?L1通路的藥物在晚期癌癥（如黑色素瘤、非小細胞型肺癌和腎細胞癌）表現(xiàn)出良好的臨床效果。放療本身被認為是免疫抑制，不僅對腫瘤細胞DNA造成損傷，而且也存在免疫介導(dǎo)的細胞凋亡［3?4］。為逃避宿主的免疫反應(yīng)，癌細胞經(jīng)常發(fā)展為程序性PD?L1，并隨后誘導(dǎo)T細胞凋亡［5］。PD?L1與惡性腫瘤的關(guān)系在多種腫瘤中已被證實，其高表達提示患者預(yù)后不良［6］。但關(guān)于PD?L1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展以及患者預(yù)后過程中發(fā)揮的作用仍存在爭議。有研究表明，高表達PD?L1的乳腺癌具有更強的侵襲性［7］；但矛盾的是，也有研究結(jié)果顯示高狀態(tài)的PD?L1改善乳腺癌患者預(yù)后［8］。盡管乳腺癌被認為是低免疫原性癌癥，但近期大量研究數(shù)據(jù)表明PD?L1通路在乳腺癌中存在活性［9?11］。因此，聯(lián)合應(yīng)用放療和免疫治療的方式可能會為乳腺癌治療提供新的治療方案。

本研究采用癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，分析PD?L1在乳腺癌中的表達特點及與臨床病理相關(guān)性，并依據(jù)CD274mRNA在樣本中表達情況對患者進行分組，探討PD?L1與放療敏感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集和篩選利用TCGA?Assembler（https：//omictools.com/tcga?assembler?tool）工具下載TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）浸潤性乳腺癌臨床和RNA seq V2數(shù)據(jù)集。截止TCGA數(shù)據(jù)更新到2017年7月下載的樣本數(shù)為1224例。首先，對樣本資料預(yù)處理，剔除正常乳腺組織樣本（113例）；其次，對下載的臨床資料預(yù)處理，刪除男性、不明性別、缺失隨訪記錄（存活時間及狀態(tài)）的患者。最終獲得1007例患者的臨床數(shù)據(jù)集。臨床資料包括生存時間、存活狀態(tài)、患病及死亡年齡、外科術(shù)式、術(shù)后組織邊緣狀況和治療資料；病理資料包括組織學(xué)分型、激素狀態(tài)、TNM分期、T、N、M期等。最后，根據(jù)TCGA庫中患者編號將樣本RNA seq數(shù)據(jù)和臨床資料合并。

1.2 臨床病理參數(shù)分析及乳腺癌分子分型樣本資料中包含正常乳腺組織113例，乳腺癌組織樣本1101例。根據(jù)mRNA測序結(jié)果，正常乳腺組織中CD274（PD?L1）表達量為 1.98～163.39，中位表達值為26.59；乳腺癌組織中表達量為0～772.59，中位表達值為19.77。根據(jù)TNM分期，Ⅰ期167例、Ⅱ期570例、Ⅲ期233例、Ⅳ期18例。1007例患者中剔除雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮生長因子2（human epidermal growth factor 2，HER2）缺失及狀態(tài)不明患者，按其免疫組化結(jié)果分為：Luminal A型（ER或PR+，HER2?）405例（61.93%）、Luminal B型（ER或PR+，HER2+）113例（17.28%）、HER2型（ER和PR?，HER2+）32例（4.89%）、Basal型（ER?，PR?，HER2?）104例（15.90%）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析本研究以總樣本中CD274 mRNA中位表達值作為PD?L1高、低狀態(tài)組劃分依據(jù)。首先對樣本中臨床病理、治療資料和PD?L1狀態(tài)信息進行數(shù)字化賦值。采用χ2檢驗推斷PD?L1表達狀態(tài)與臨床病理參數(shù)關(guān)系。采用Kaplan?Meier單因素和Cox回歸多因素進行生存分析。所有數(shù)據(jù)分析均在“R”3.4.0（http：//www.r?project.org）軟件完成，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 PD?L1狀態(tài)和臨床病理資料與預(yù)后關(guān)系1007例乳腺癌患者臨床預(yù)后特點見表1。患者平均年 齡（58.1±13.0）歲 ，術(shù) 后 平 均 生 存 時 間 為（41.9±34.6）個月。單因素分析結(jié)果顯示，年齡（P=0.001）、TNM 分 期 、術(shù) 后 邊 緣 狀 態(tài)（P=0.006）、化療（P=0.001）、放療（P=0.007）和 PD?L1狀態(tài)（P=0.047）有統(tǒng)計學(xué)意義；多因素分析結(jié)果顯示TNM分期和化療（P=0.002）具有統(tǒng)計學(xué)意義。單因素分析結(jié)果顯示，高狀態(tài)的PD?L1相比低狀態(tài)的 PD?L1改善患者預(yù)后（HR=0.682，95%CI 0.467～0.994，P=0.047），故推測 PD?L1 可能為乳腺癌抑制基因。

表1 本組1007例乳腺癌患者特征分析Table 1 Characteristics of 1007 patients with breast cancer

2.2 PD?L1狀態(tài)對放療生存率影響PD?L1高低狀態(tài)組患者臨床病理與患者預(yù)后關(guān)系見表2。高狀態(tài)組單因素分析提示，患病年齡、TNM分期和術(shù)后邊緣狀態(tài)對患者總生存率影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期對患者總生存率有統(tǒng)計學(xué)意義。PD?L1低狀態(tài)組TNM分期和放療在單因素和多因素分析中均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PD?L1高狀態(tài)組患者是否接受放療總生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。然而低狀態(tài)組放療患者放療后總生存率得到顯著改善（HR=0.550，95%CI 0.335～0.904，P=0.017），多因素分析校正后仍存統(tǒng)計學(xué)意義（HR=0.415，95%CI 0.194～0.872，P=0.025）。圖1示PD?L1高低狀態(tài)組在同一TNM分期情況下放療和非放療患者生存曲線。結(jié)果顯示在Ⅱ期患者中，PD?L1低狀態(tài)的放療患者總生存率得到改善；調(diào)整患病年齡、組織學(xué)分型、外科術(shù)式、術(shù)后邊緣狀態(tài)后差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.021）。而高狀態(tài)患者是否放療總生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Ⅲ期患者中PD?L1低狀態(tài)放療患者總生存率顯著改善；多因素調(diào)整后差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.020）。低狀態(tài)組患者接受放療總生存率提高，說明乳腺癌中低狀態(tài)的PD?L1患者存在放療敏感性。

2.3 PD?L1狀態(tài)與臨床病理關(guān)系ER狀態(tài)（χ2=18.44，P＜0.001）、HER2 狀態(tài)（χ2=7.943，P=0.047）和分子分型（χ2=14.52，P=0.006）與PD?L1表達存在關(guān)聯(lián)，而年齡、組織學(xué)分型、外科處理術(shù)式、術(shù)后組織邊緣狀況和PR狀態(tài)與其表達狀態(tài)無關(guān)聯(lián)性。

表2 PD?L1高、低狀態(tài)組乳腺癌患者特征分析Table 2 Characteristics of breast cancer patients between the two groups

圖1 PD?L1高、低狀態(tài)組放療患者生存曲線Figure 1 Survival curve of the patients between two groups

3 討 論

乳腺癌在篩查、治療和生存方面取得了巨大進展，但如今仍是女性最常見惡性腫瘤和死亡常見原因。隨著進入基因測序時代，使得在基因組水平上的精準治療方案引起學(xué)者廣泛探索。因此，尋找基因?qū)用娴闹委煱悬c可能為乳腺癌提供新的治療方案。有研究顯示乳腺癌的局部控制和良好預(yù)后得益于術(shù)后的輔助放療［12?13］。心臟毒性和放射性肺損傷是放療的重要并發(fā)癥，且并不是所有患者接受放療受益。因此，尋找放療領(lǐng)域的敏感性標記物尤為重要。

本研究利用TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)庫首先分析了PD?L1表達狀態(tài)與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系.結(jié)果顯示高狀態(tài)的PD?L1改善患者預(yù)后，其狀態(tài)與ER狀態(tài)、HER2狀態(tài)和分子分型存在關(guān)聯(lián)性。該結(jié)果與既往多項研究描述的高狀態(tài)PD?L1改善乳腺癌患者預(yù)后，且表達狀態(tài)與分子分型密切相關(guān)的結(jié)論相符［8，10，14］；與 Zhang等［7］和 Tao等［15］研究結(jié)果提示的高狀態(tài)的PD?L1增加乳腺癌侵襲性存在一定差異。其次，本研究驗證了PD?L1狀態(tài)與患者放療敏感性關(guān)系。單因素和多因素分析結(jié)果顯示，PD?L1低狀態(tài)組放療患者總生存率得到改善；高狀態(tài)組，患者是否放療總生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示，高狀態(tài)的PD?L1改善患者總預(yù)后，但在PD?L1高狀態(tài)組中患者是否放療生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在PD?L1低狀態(tài)患者中接受放療生存率改善，提示PD?L1可能為乳腺癌放療敏感性基因。

隨著對腫瘤微環(huán)境研究的深入，PD?L1引起學(xué)者們的廣泛興趣，大量數(shù)據(jù)表明PD?L1通路可能是多種癌癥的一種活躍的免疫檢查點［16］。PD?L1是9q24編碼的40kDa跨膜蛋白，與活化的細胞毒性T細胞表面表達的PD?1受體結(jié)合。PD?1/PD?L1相互作用可作為抗原和自身免疫的調(diào)節(jié)核查站。PD?L/PD?L1結(jié)合后阻止T細胞活化的下游信號，抑制CD3/CD28介導(dǎo)的T細胞轉(zhuǎn)錄作用，使腫瘤細胞逃避T淋巴細胞的殺傷作用［17］。然而，該過程中發(fā)生了磷脂酰肌醇激酶的磷酸化、蛋白激酶B的激活、葡萄糖代謝等系列生化反應(yīng)［18］。有研究顯示，放療過程中的細胞代謝通路廣泛參與免疫識別和凋亡細胞的清除［19］。此過程中PD?1和PD?L1結(jié)合率是影響放療療效的重要因素，因此，PD?L1表達狀態(tài)可能對放射療效產(chǎn)生一定影響。

放療過程中的NDA修復(fù)是放療抵抗的重要因素之一。放療造成不同類型的DNA損傷，同時引發(fā)DNA的損傷修復(fù)反應(yīng)以克服細胞損傷和基因的不穩(wěn)定性；而P53基因的表達是該修復(fù)過程中重要環(huán)節(jié)［20?21］。Yang等［22］研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者中PD?L1的表達與P53陽性表達呈正相關(guān)。通過本研究PD?L1低狀態(tài)患者存在較好的放療敏感性可能與低表達的P53抑制放療過程中的細胞損傷修復(fù)密切聯(lián)系。

放療通過誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的干擾素?γ并激活T細胞而引發(fā)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生療效［23］。有報道顯示，放射后腫瘤細胞中PD?L1水平升高，抑制CD8+T細胞功能［24］。因此，放療過程中阻斷PD?L1表達，在一定程度上克服PD?L1表達升高引起的放療抵抗。然而，既往研究主要集中在單一的免疫抑制劑研究或放射治療后PD?L1表達狀態(tài)探索；本研究則是利用TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者放療前腫瘤組織中PD?L1的表達水平，在基礎(chǔ)條件下研究PD?L1表達狀態(tài)與放療敏感性關(guān)系。免疫治療成為腫瘤治療的重要手段，其聯(lián)合免疫抑制劑的靶向放療可能為乳腺癌治療提供新可能和研究思路。

本研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌臨床資料和mRNA二代測序數(shù)據(jù)進行探討PD?L1狀態(tài)如乳腺癌放療敏感性關(guān)系。基于PD?L1在乳腺癌中的表達及其微環(huán)境的治療策略有著巨大的發(fā)展?jié)摿?，后續(xù)還需要進一步的試驗來驗證PD?L1放療敏感性生物標記的價值。