FAM3C通過激活Akt 促進口腔鱗癌細胞活力*

遲毓婧，李 玫，禹祎萌，劉愛禹，郁衛(wèi)東，莫 珩

(北京大學人民醫(yī)院 1中心實驗室和臨床分子生物學研究所， 2口腔科， 北京 100044)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous-cell carcinoma, OSCC)是常見的腫瘤，占口腔惡性病變的95%，近二十年其發(fā)病率不斷上升[1]，尤其是在年輕患者中，全球每年新增病例超過30萬，盡管近年來對于OSCC的診斷和治療有實質(zhì)性進步，但其5年生存率仍然僅為50%[2]。因此亟待找出新的治療靶點對OSCC進行特異性的干預，以其提高OSCC患者的生存率。

FAM3(family with sequence similarity 3)家族是2002年克隆的一個細胞因子樣基因家族，包括4個成員：FAM3A (FAM3, member A)、FAM3B (FAM3, member B)、FAM3C (FAM3, member C)和FAM3D (FAM3, member D)。FAM3C也被稱作白細胞介素樣上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導因子(interleukin-like epithelial-mesenchymal transition inducer, ILEI)，在人和小鼠全身多種組織中高度表達[3]。目前的研究報道，F(xiàn)AM3C作為一種新型的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及轉(zhuǎn)移的調(diào)控分子，在結(jié)腸癌[4]、胰腺癌[5]和食管鱗狀細胞癌[6]等的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

最新的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM3C在患者OSCC組織中呈現(xiàn)高表達，并且與患者的不良預后密切相關[7]，但目前對于FAM3C參與OSCC發(fā)生發(fā)展的具體機制尚未有研究報道。蛋白激酶B (protein kinase B,Akt)已被認為是一種重要的原癌基因，在多種腫瘤，尤其是低分化腫瘤中存在Akt的激活，并具有更高的轉(zhuǎn)移風險和更差的預后[8]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)在小鼠肝臟及肝細胞中過表達FAM3C能顯著激活Akt[9-10]。FAM3C是否也能通過激活Akt參與OSCC的增殖仍然未知。本文分別在口腔鱗癌癌前病變細胞DOK和口腔鱗癌細胞WSU-HN6中，初步探究FAM3C的表達變化及其影響OSCC細胞活力的機制，以期為OSCC的臨床診療提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 主要儀器和試劑

實時定量PCR儀和酶標儀(Bio-Red)；凝膠成像儀(GE)；CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo)。胎牛血清(Corning)；高糖DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素(Gibco)；細胞活力檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8; Dojindo)；高效真核轉(zhuǎn)染試劑Vigofect(北京威格拉斯生物技術有限公司)；TRIzol和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)；實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)試劑盒(TOYOBO)；PCR引物購自上海生工生物股份有限公司；蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和PMSF(北京普利萊基因技術有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白marker和化學發(fā)光試劑盒(Thermo)；硝酸纖維素膜(Pall)；抗FAM3C抗體(Abcam)；抗p-Akt和Akt抗體(Cell Signaling Technology)；抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(中杉金橋)。DOK口腔癌前病變細胞系和WSU-HN6口腔鱗癌細胞系由北京大學口腔醫(yī)院提供。

2 主要方法

2.1細胞培養(yǎng)及處理 口腔鱗癌癌前病變細胞系DOK和口腔鱗癌細胞系WSU-HN6使用添加青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)，細胞傳代使用0.25%的胰蛋白酶消化。WSU-HN6細胞使用抗FAM3C抗體(2.5 mg/L)處理(WSU-HN6+anti-FAM3C)，對照(WSU-HN6+solvent)組使用抗體溶劑處理，24、48和72 h后進行CCK-8實驗檢測細胞活力，并提取細胞的總RNA及總蛋白進行后續(xù)實驗。DOK細胞分別使用感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=50的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)腺病毒(adenovirus-GFP，Ad-GFP)和FAM3C腺病毒(adenovirus-FAM3C, Ad-FAM3C)腺病毒處理細胞，24、48和72 h后進行CCK-8實驗檢測細胞活力，并提取細胞的總RNA及總蛋白進行后續(xù)實驗。

2.2siRNA細胞轉(zhuǎn)染 WSU-HN6細胞分別轉(zhuǎn)染對照(WSU-HN6+scramble)和FAM3CsiRNA(WSU-HN6+siFAM3C)，轉(zhuǎn)染前1 h更換新鮮培養(yǎng)液，首先將4條siRNA的混合物(50 nmol/L)與生理鹽水混合5 min，同時將轉(zhuǎn)染試劑(Vigofect)與生理鹽水混合5 min，之后將2種混合15 min后逐滴加入到6孔板或96孔板中，轉(zhuǎn)染4 h后更換為新鮮培養(yǎng)液，在轉(zhuǎn)染后24、48和72 h后進行CCK-8檢測細胞活力，并提取細胞的總RNA及總蛋白進行后續(xù)實驗。siRNA序列見表1。

表1 siFAM3C序列

2.3CCK-8法檢測細胞活力 DOK和WSU-HN6細胞各取3×103個細胞種植在96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，分別在不同處理的0、24、48及72 h更換培養(yǎng)液并加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)2 h后，使用酶標儀在450 nm處進行吸光度(A)值的測定，每種處理重復4次，設置3個復孔，以A值為縱坐標，處理時間為橫坐標繪制生長曲線。

2.4RT-qPCR 每孔細胞使用1 mL RNA裂解液(TRIzol)提取細胞總RNA，測定總RNA濃度后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄2μg的cDNA。使用含有SYBR Green 1熒光染料的PCR混合物進行實時定量熒光PCR，以β-actin作為內(nèi)參照，引物序列見表2。依據(jù)公式2-ΔΔCt法計算FAM3C mRNA的相對表達量。

表2 RT-qPCR引物序列

2.5Western blot實驗 每孔細胞加入60 μL蛋白裂解液，15 520×g離心15 min后取上清，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定細胞總蛋白的濃度。使用40 μg的細胞總蛋白進行SDS-PAGE，電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%奶粉室溫封閉1 h后加入抗FAM3C、p-Akt(Ser473)、Akt及β-actin抗體，4 ℃過夜。第2天孵育Ⅱ抗，采用化學發(fā)光法檢測目的蛋白的表達，ImageJ軟件分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，使用t檢驗進行兩組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 口腔鱗癌細胞中FAM3C的表達上調(diào)

與癌前病變DOK細胞相比，WSU-HN6細胞中FAM3C mRNA表達顯著升高(P<0.05)，見圖1A。在WSU-HN6細胞中FAM3C的蛋白表達水平也較DOK細胞顯著升高(P<0.01)，同時FAM3C的下游分子p-Akt蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.01)，總Akt蛋白的表達水平無顯著差異，見圖1B。

Figure 1.The mRNA and protein expression of FAM3C and the phosphorylation of Akt in DOK and WSU-HN6 cells. A: the mRNA expression of FAM3C in DOK and WSU-HN6 cells; B: the protein expression of FAM3C and p-Akt in DOK and WSU-HN6 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDOK group.

圖1DOK與WSU-HN6細胞中FAM3CmRNA及蛋白表達水平和Akt磷酸化水平

2 siRNA敲減FAM3C抑制WSU-HN6細胞的活力

WSU-HN6細胞在siFAM3C處理24、48和72 h，F(xiàn)AM3C的mRNA表達均顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖2A。與對照(WSU-HN6+scramble)組相比，siFAM3C處理(WSU-HN6+siFAM3C)組WSU-HN6細胞的活力在48 h和72 h顯著受到抑制(P<0.05),見圖2B。siFAM3C處理后24、48和72 h，F(xiàn)AM3C蛋白表達水平下降，p-Akt蛋白的表達顯著受到抑制(P<0.01)，但總Akt的蛋白表達沒有變化，見圖2C。

3 抗體封閉FAM3C蛋白抑制WSU-HN6細胞的活力

與溶劑處理的對照(WSU-HN6+solvent)組相比，F(xiàn)AM3C抗體(WSU-HN6+anti-FAM3C組)在48 h和72 h可以顯著抑制WSU-HN6細胞的活力(P<0.05),見圖3A;FAM3C抗體處理24、48和72 h均能顯著抑制p-Akt蛋白的表達(P<0.05)，但對總Akt的蛋白表達沒有影響，見圖3B。

4 腺病毒介導過表達FAM3C促進DOK細胞的活力

DOK細胞過表達FAM3C(DOK+Ad-FAM3C)24、48和72 h后，F(xiàn)AM3C的mRNA水平均上調(diào)(P<0.05),見圖4A。與對照(DOK+Ad-GFP)組相比，過表達FAM3C(DOK+Ad-FAM3C)可以在48 h和72 h顯著促進DOK細胞的活力(P<0.05),見圖4B，并在24、48和72 h促進p-Akt蛋白的表達(P<0.05)，但對總Akt的蛋白表達沒有影響，見圖4C。

Figure 2.siRNA-mediatedFAM3Cknockdown (siFAM3C) inhibited the viability of WSU-HN6 cells. A: RT-q PCR was used to detected the FAM3C mRNA expression after siFAM3C treatment for 24, 48 and 72 h; B: WSU-HN6 cell viability detected by CCK-8 assay; C: FAM3C, p-Akt and Akt protein expression after siFAM3C or scramble treatment for 24, 48 and 72 h. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWSU-HN6+scramble group.

圖2siRNA敲減FAM3C抑制WSU-HN6細胞的增殖

Figure 3.FAM3C antibody (anti-FAM3C) inhibited WSU-HN6 cell viability. A: WSU-HN6 cell viability detected by CCK-8 assay; B: FAM3C, p-Akt and Akt protein expression in WSU-HN6 cells after anti-FAM3C or solvent treatment for 24, 48 and 72 h. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWSU-HN6+solvent group.

圖3抗體封閉FAM3C蛋白抑制WSU-HN6細胞的活力

討 論

本項工作比較了癌前病變細胞DOK和口腔鱗癌細胞WSU-HN6中FAM3C的mRNA 和蛋白的表達水平，并檢測到在口腔鱗癌細胞WSU-HN6中FAM3C的mRNA和蛋白的表達水平均顯著高于癌前病變細胞DOK，這一結(jié)果與最新研究觀察到在患者OSCC組織中FAM3C的表達顯著高于正常黏膜及上皮異常增生組織一致[7]。此外在乳腺癌、肝癌和胃癌中，也有研究報道FAM3C在患者的腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達，并且與患者預后不良密切相關[11-13]。由此可見FAM3C表達的增加可能與OSCC的發(fā)生及發(fā)展相關。

Figure 4.Adenovirus-mediated FAM3C overexpression (Ad-FAM3C) promoted DOK cell viability. A: RT-qPCR was used to detected the FAM3C mRNA expression after FAM3C overexpression for 24, 48 and 72 h; B: DOK cell viability detected by CCK-8 assay; C: FAM3C, p-Akt and Akt protein expression after Ad-FAM3C or Ad-GFP treatment for 24, 48 and 72 h. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDOK+Ad-GFP group.

圖4腺病毒介導過表達FAM3C促進DOK細胞的活力

細胞活力異常是導致OSCC發(fā)生的一個重要的原因[14]。本研究在高表達FAM3C的WSU-HN6細胞中使用siFAM3C抑制FAM3C mRNA的表達，在處理48 h后細胞的活力顯著被抑制，同時使用抗FAM3C的抗體處理得到了同樣的結(jié)果；而在低表達FAM3C蛋白的DOK細胞中使用FAM3C腺病毒過表達能顯著提高細胞活力，提示FAM3C可能通過調(diào)控細胞活力參與OSCC的發(fā)生和發(fā)展。另有研究報道在非轉(zhuǎn)移性的乳腺上皮細胞EpC40中，過表達FAM3C可促進腫瘤細胞的生長[15]，并可誘導其EMT過程[16-18]。在乳腺癌和黑色素瘤細胞中下調(diào)FAM3C的表達能顯著抑制腫瘤的侵襲和EMT[19]。

本研究中，敲減FAM3C在抑制OSCC細胞活力的同時也能抑制Akt的激活，而過表達FAM3C則能顯著激活Akt。已有文獻報道，在OSCC患者中，均存在p-Akt水平升高[20-21], 及其與OSCC預后不良呈正相關[20]。中國漢族人群Akt1基因點突變位點與OSCC的發(fā)病率及生存率有關[22]。p-Akt通過磷酸化調(diào)控下游cyclin D1、細胞凋亡蛋白Bad、細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑p21Cip1等的表達參與調(diào)控細胞增殖、生長和生存等多種進程[23], 由此推測FAM3C可能通過激活Akt提高OSCC細胞活力。在胃癌細胞系中，敲減FAM3C不能影響胃癌細胞活力，但是卻能激活Akt并抑制細胞的遷移及EMT過程[13]，在腎小管細胞系HK2中也觀察到FAM3C可能通過Akt誘導EMT[24]。對于FAM3C是如何激活Akt，本課題組既往研究觀察到FAM3C可能通過熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factor 1，HSF1)-鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)激活Akt調(diào)控肝臟的糖脂代謝[9-10]，而對于FAM3C在OSCC發(fā)生和發(fā)展過程中參與到Akt所調(diào)控的具體事件，尚待深入研究。

目前對FAM3C在OSCC中的研究，僅為其在OSCC患者組織中表達上調(diào)及與患者預后的相關性[7]，尚未見FAM3C參與OSCC的具體機制研究。本研究首次觀察到FAM3C可能通過激活Akt促進OSCC細胞活力，可能是OSCC發(fā)生及發(fā)展的原因之一。本研究可能為今后OSCC的臨床診療及提高OSCC的生存率提供了新參考資料。