電針調(diào)控microRNA-34a對(duì)缺血再灌注損傷大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響

柳維林，鄭薏，金婷婷，張宇豪，施丹，陳立典，陶靜

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是一群能夠自我更新并具多向分化潛能的細(xì)胞，它主要分布在海馬齒狀回、腦室管膜下區(qū)，在適當(dāng)條件下可分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧缺血情況下，海馬齒狀回和室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)等部位的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞可增殖、遷移并分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這提示內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞參與中樞神經(jīng)損傷的修復(fù)[1]。但腦缺血后可誘導(dǎo)反應(yīng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞重新表達(dá)巢蛋白(Nestin)和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)，提示腦缺血損傷的修復(fù)機(jī)制可能與其密切相關(guān)，同時(shí)也可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)的敏感指標(biāo)之一[2]。近年來有研究認(rèn)為，Nestin+/GFAP+細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞或膠質(zhì)前體細(xì)胞，在腦缺血后Nestin反應(yīng)性表達(dá)可能是神經(jīng)干細(xì)胞分化而來，也可能是腦缺血后具有分化潛能的神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞[3-4]。Shimada等[5]在GFAP+/+轉(zhuǎn)基因大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Nestin+/GFAP+細(xì)胞顯著增加，通過對(duì)其原代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞。

近期研究報(bào)道，電針能促進(jìn)缺血再灌注大鼠SVZ和海馬齒狀回Nestin+細(xì)胞、GFAP+細(xì)胞增殖和分化，從而促進(jìn)神經(jīng)再生，改善功能恢復(fù)[6-7]。已有許多研究證實(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化受到microRNAs(miRNAs)的調(diào)控[8]。miRNAs是一種內(nèi)源性非編碼RNA(由18～23個(gè)核苷酸組成)，能夠與特定mRNA3'UTR不完全或完全互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶mRNA的翻譯或促使其降解，從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、代謝和凋亡等生物學(xué)過程。microRNA-34a(miR-34a)在大腦中有特異性表達(dá)，是miR-34家族的一員，越來越多的證據(jù)表明，在細(xì)胞分化的過程中，miR-34a起到非常重要的調(diào)控作用[9-10]。

本文試圖闡明電針曲池和足三里是否是通過調(diào)控miR-34a促進(jìn)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血周邊區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，從而為電針治療腦卒中提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠124只，16周齡，體質(zhì)量250～275 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供，許可號(hào)SCXK(滬)2014-002。由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，許可號(hào)SYXK(閩)2014-001。實(shí)驗(yàn)過程所有動(dòng)物相關(guān)的處理嚴(yán)格按照國(guó)際動(dòng)物倫理準(zhǔn)則和使用指南的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

Nestin單抗、GFAP單抗、5-溴代-2'-脫氧尿苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)多抗：ABCAM公司。βactin多抗、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗：美國(guó)CST公司。miR-34a引物、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒：廣州復(fù)能基因公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

將108只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組36只，每組再分為3 d、7 d和14 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)12只。另外16只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為電針+miR-34a抑制劑組和電針+二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)組，每組8只。DMSO為miR-34a的溶解液，設(shè)立電針+DMSO組作為電針+miR-34a抑制劑組的對(duì)照組。

電針組在造模后第2天取患側(cè)肢體曲池(LⅠ11：橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中)、足三里(ST36：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處)，穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]。局部消毒后，用華佗牌30號(hào)0.5寸毫針，針刺深度2～3 mm，接G6805型電針儀，電壓峰值6 V，以大鼠肢體輕輕抖動(dòng)為度，選用疏密波1/20 Hz，每次30 min，每天1次，共14 d。同時(shí)，造模后第2天至第14天各組進(jìn)行腹腔注射BrdU，每天2次，每次注射間隔8 h。DMSO溶解液、miR-34a抑制劑在造模前進(jìn)行側(cè)腦室注射。

1.4 造模

實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前24 h禁食，不禁水。采用改良Longa法[12]制備局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀Ｊ中g(shù)過程采用1.5%異氟烷氣體麻醉。大鼠先處于俯臥，矢狀位剪開額頂部皮膚約2 cm，暴露皮下筋膜，用浸滿雙氧水的棉簽?zāi)Σ帘┞兜慕钅?，直至暴露出顱骨前囟及左側(cè)半顱骨。將激光多普勒血流儀的探頭固定于前囟向左5 mm、向后3 mm定位點(diǎn)上，開始記錄左側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域血流變化值，當(dāng)所示數(shù)值平穩(wěn)，開始制作MCAO模型。

將大鼠輕放至仰臥位(注意探針)并固定，取頸部正中開口1.5～2 cm，暴露分離頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)、 頸 內(nèi) 動(dòng) 脈 (internal carotid artery,ⅠCA)。 結(jié) 扎CCA近心端及ECA，用微動(dòng)脈夾夾閉遠(yuǎn)端ⅠCA，在距CCA分叉處1.0 cm處用顯微剪刀剪一切口，采用直徑為0.2 mm尼龍線，頭端涂上硅膠，使頂端直徑約為0.22～0.25 mm，自左側(cè)CCA插入ⅠCA至有少許阻力為止(自ECA與ⅠCA分叉處起計(jì)算插入約18～22 mm)，線栓到達(dá)大腦中動(dòng)脈分支處，此時(shí)激光多普勒血流儀顯示血流下降至基礎(chǔ)值的20%～30%[13]，即為栓塞成功，再固定線栓，頸部傷口縫合。待缺血2 h后回抽線栓至CCA分叉處，恢復(fù)再灌注，此時(shí)MCAO模型制備完成。

假手術(shù)組只分離CCA、ⅠCA和ECA，但不結(jié)扎、插線，稍后縫合傷口。手術(shù)結(jié)束后，所有動(dòng)物放置于25℃室溫環(huán)境下蘇醒，保持正常飲水、飲食，直到動(dòng)物恢復(fù)活動(dòng)。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)估

采用Longa評(píng)分評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損[14]，電針前、電針后3 d、7 d和14 d，對(duì)假手術(shù)組、模型組和電針組進(jìn)行神經(jīng)癥狀評(píng)分，評(píng)分0～4分。

1.6 CatWalk動(dòng)物步態(tài)分析

假手術(shù)組、模型組和電針組大鼠造模前，首先進(jìn)行CatWalk適應(yīng)性訓(xùn)練1周。訓(xùn)練合格標(biāo)準(zhǔn)[15]：大鼠連續(xù)不停頓地成功通過通道至少3次，由于大鼠造模后急性損傷嚴(yán)重，無法進(jìn)行測(cè)試，因此只在造模前3 d記錄其基線數(shù)據(jù)。大鼠在干預(yù)3 d、7 d和14 d后，三組均接受CatWalk系統(tǒng)步態(tài)分析檢測(cè)，計(jì)算患側(cè)右前爪和右后爪的爪印面積和壓強(qiáng)。

1.7 免疫熒光染色

采用免疫熒光染色觀察BrdU、Nestin與GFAP的共定位情況。大鼠在造模后14 d后，3%異氟烷麻醉，PBS和4%多聚甲醛灌流，每組取大鼠4只，取全腦組織，放入4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋；5μm石蠟切片，脫蠟，透明；抗原修復(fù)和DNA變性，封閉；滴加一抗(Nestin，1∶150；GFAP，1∶500；BrdU，1∶500)，置濕盒中4℃孵育過夜，PBS沖洗；滴加FⅠTC標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶500)，37℃避光孵育2 h，PBS沖洗；DAPⅠ復(fù)染；抗熒光淬滅處理及封片觀察。在400×熒光顯微鏡下選取不重疊的6個(gè)視野，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 miR-34a表達(dá)檢測(cè)

采用RT-qPCR檢測(cè)缺血周邊區(qū)miR-34a相對(duì)表達(dá)量。以U6 snRNA作為內(nèi)參，檢測(cè)電針干預(yù)7 d后各組大鼠缺血周圍皮質(zhì)區(qū)miR-34a在相對(duì)于表達(dá)量。每組取大鼠4只，取左側(cè)缺血周邊區(qū)腦組織提取總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄，ABⅠ7500熒光定量PCR擴(kuò)增miR-34a表達(dá)量。采用相對(duì)定量的方法表示表達(dá)量，即處理樣本相對(duì)于未處理樣本的倍數(shù)(2-△△Ct)。

當(dāng)2-△△Ct＞1，目的基因表達(dá)上調(diào)，反之則下調(diào)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料均以(±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)；多組均數(shù)間的比較采用One-Way ANOVA，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Longa評(píng)分

各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均正常。模型組和電針組在缺血再灌注24 h(電針干預(yù)前基線)明顯出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損，但兩組評(píng)分無顯著性差異(P＞0.05)。而電針組3 d、7 d和14 d Longa評(píng)分低于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組Longa評(píng)分比較

2.2 CatWalk步態(tài)參數(shù)

模型組患側(cè)肢體的爪印面積(右前爪、右后爪)、最大壓強(qiáng)(右前爪、右后爪)與同時(shí)間假手術(shù)組比較均下降(P＜0.05)，模型組隨著時(shí)間延長(zhǎng)右后爪印面積增加(P＜0.05)。電針組患側(cè)肢體的爪印面積(右前爪、右后爪)與同時(shí)間模型組比較增加(P＜0.05)。電針干預(yù)3 d和7 d后，電針組患側(cè)最大壓強(qiáng)(右前爪、右后爪)與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)；14 d后電針組大于模型組(P＜0.05)。電針干預(yù)3 d至7 d，電針組右后爪印面積與右前最大壓強(qiáng)逐漸增加，一定程度上呈時(shí)間依賴性(P＜0.05)。見表2～表5。

2.3 Nestin+/GFAP+細(xì)胞表達(dá)

隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，Nestin+/GFAP+細(xì)胞在缺血周邊區(qū)表達(dá)逐漸增多，在7 d達(dá)到高峰，14 d表達(dá)下降，但模型組各時(shí)間點(diǎn)比較無顯著性差異(P＞0.05)。同時(shí)間點(diǎn)比較，電針組Nestin+/GFAP+細(xì)胞應(yīng)激性表達(dá)均明顯增加(P＜0.01)，且在7 d表達(dá)最多(P＜0.01)。見表6、圖1。

2.4 BrdU+/GFAP+表達(dá)

缺血再灌注損傷后，模型組和電針組缺血周邊區(qū)均有表達(dá)BrdU+與GFAP+細(xì)胞，且呈BrdU+/GFAP+雙陽(yáng)性共表達(dá)。但隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，BrdU+/GFAP+細(xì)胞表達(dá)在7 d達(dá)到高峰，在14 d表達(dá)下降，但14 d與7 d相比無顯著性差異(P＞0.05)。同時(shí)間點(diǎn)，電針組BrdU+/GFAP+雙陽(yáng)性細(xì)胞均明顯多于模型組(P＜0.01)，且在7 d增加最多(P＜0.05)。見圖2和表7。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)右前爪爪印面積比較(cm2)

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)右前爪最大壓強(qiáng)比較(a.u.)

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)右后爪爪印面積比較(cm2)

表5 各組不同時(shí)間點(diǎn)右右后爪最大壓強(qiáng)比較(a.u.)

表6 各組缺血周圍皮質(zhì)區(qū)Nestin+/GFAP+細(xì)胞數(shù)量

2.5 miR-34a對(duì)BrdU+/GFAP+表達(dá)的影響

模型組、電針組和電針+DMSO溶劑組較假手術(shù)組miR-34a表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.01)，且電針組與電針+DMSO溶劑組相比無顯著性差異(P＞0.05)，而電針+miR-34a抑制劑組較電針組降低(P＜0.05)。模型組缺血7 d后BrdU+/GFAP+細(xì)胞增加，電針組BrdU+/GFAP+細(xì)胞進(jìn)一步增加，而電針+miR-34a抑制劑組較電針+DMSO組BrdU+/GFAP+細(xì)胞降低(P＜0.05)，電針+DMSO組與電針組比較無顯著性差異(P＞0.05)。此外，在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中無二抗陰性對(duì)照組沒有表達(dá)。見表8、表9和圖3。

表7 各組缺血周圍皮質(zhì)區(qū)Brd U+/GFAP+細(xì)胞數(shù)量

3 討論

針刺是傳統(tǒng)中醫(yī)療法的重要組成之一，在亞洲及西方國(guó)家已被共同認(rèn)為可作為治療腦卒中的輔助療法?！端貑?痿論篇》有曰：“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”。陽(yáng)明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，又主潤(rùn)宗筋，“陽(yáng)明虛則宗筋縱，宗筋縱則不能束筋骨以流利機(jī)關(guān)”。故陽(yáng)明經(jīng)穴對(duì)于腦卒中之肢體痿痹的治療尤為適宜，而曲池和足三里均為陽(yáng)明經(jīng)之穴。

曲池：曲，屈曲。屬手陽(yáng)明大腸經(jīng)之合穴，出自《靈樞?本輸》。曲池穴功善調(diào)和氣血，疏通經(jīng)絡(luò)等作用。曲池穴歷代文獻(xiàn)研究中與腦卒中聯(lián)系密切，《針灸大全》：“中風(fēng)偏枯，痛疼無時(shí)?！囟ā薄！毒霸廊珪罚骸熬氖肿悴凰?、偏枯等證：曲池、足三里等穴。”

圖2 各組Brd U+/GFAP+免疫熒光雙標(biāo)情況(免疫熒光染色，×200)

表8 各組大鼠缺血周圍皮質(zhì)區(qū)miR-34a相對(duì)表達(dá)量

表9 各組缺血周圍皮質(zhì)區(qū)Brd U+/GFAP+細(xì)胞數(shù)量

足三里始載于《內(nèi)經(jīng)》，治療腦卒中，歷代醫(yī)家多有記載?！短绞セ莘健酚涊d：“凡人未中風(fēng)時(shí)，一兩月前，或三五個(gè)月前，非時(shí)，足脛上忽發(fā)酸重頑痹，良久方解，此乃將中風(fēng)之候也，便須急灸三里穴與絕骨穴?！薄缎l(wèi)生寶鑒》亦有云：“凡覺手足麻痹或疼痛，良久乃已，此將中腑之候，宜灸此七穴(百會(huì)、發(fā)際、肩髑、曲池、風(fēng)市、足三里、絕骨)凡覺心中憒亂，神思不怡，或手足麻痹，此中臟之候也。不問是風(fēng)與氣，可連灸此七穴(百會(huì)、大椎、風(fēng)池、肩井、曲池、足三里、間使)”。

故選取手足陽(yáng)明經(jīng)曲池和足三里二穴組合具有疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)理氣血陰陽(yáng)平衡，扶正祛邪，則使腦卒中后機(jī)體功能得到最大限度的恢復(fù)。同時(shí)，已有大量文獻(xiàn)證實(shí)，針灸可有效治療腦卒中后運(yùn)動(dòng)功能障礙，臨床上電針曲池和足三里兩穴組合治療軟癱期和恢復(fù)期的腦卒中患者能有效改善運(yùn)動(dòng)功能、肌張力、Fugl-Meyer評(píng)定量表評(píng)分和改良Ashworth量表評(píng)分[16]。已有研究證實(shí)，電針腦缺血再灌注損傷大鼠足三里和曲池可促進(jìn)神經(jīng)功能缺損恢復(fù)等神經(jīng)保護(hù)作用[17-18]。但其具體作用機(jī)制尚未完全清楚。

當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，如缺血性腦卒中，神經(jīng)干細(xì)胞被激活進(jìn)入增殖分化階段，通過不對(duì)稱的分裂轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)前體細(xì)胞，然后遷移到達(dá)特定區(qū)域并分化成神經(jīng)細(xì)胞，提示新生的神經(jīng)細(xì)胞可能為腦缺血后機(jī)體功能的恢復(fù)提供機(jī)制[19-20]。腦缺血后缺血側(cè)海馬齒狀回、SVZ以及缺血周邊區(qū)均發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[21]，因此我們把缺血周邊區(qū)作為觀察神經(jīng)干細(xì)胞的區(qū)域。

圖3 各組7 d時(shí)Brd U+/GFAP+免疫熒光雙標(biāo)情況(免疫熒光染色，×200)

根據(jù)不同的特異性分子標(biāo)記物和形態(tài)學(xué)，神經(jīng)干細(xì)胞可表達(dá)Nestin和GFAP[22]。Shimada等[23]認(rèn)為，Nestin+/GFAP+細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在缺血周圍區(qū)Nestin+/GFAP+細(xì)胞增加，并在體內(nèi)和體外證實(shí)這種細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。Shen等[24]和Liu等[25]研究也都發(fā)現(xiàn)，MCAO大鼠在腦缺血后，缺血周圍區(qū)Nestin+/GFAP+共定位細(xì)胞表達(dá)，且在7 d開始表達(dá)開始增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，缺血再灌注損傷大鼠急性期缺血皮質(zhì)周圍區(qū)有大量的Nestin+/GFAP+細(xì)胞增殖，且在缺血后7 d表達(dá)達(dá)到高峰，14 d后逐漸下降，這與Fang等[26]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

BrdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，它能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA分子，用于準(zhǔn)備標(biāo)記細(xì)胞增殖情況[27]。本研究觀察到，缺血周邊區(qū)BrdU+/GFAP+細(xì)胞在缺血周邊區(qū)表達(dá)逐漸增多，在7 d達(dá)到高峰，14 d后逐漸下降，這與先前的研究[28]一致。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[29]，在缺血海馬齒狀回區(qū)的GFAP+細(xì)胞表達(dá)隨著缺血的時(shí)間增加，表達(dá)逐漸增多，在14 d陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)最多，在21 d表達(dá)開始下降，說明GFAP的表達(dá)量與大腦缺血部位有關(guān)。

在體外小鼠胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中，過表達(dá)miR-34a可通過調(diào)控SⅠRT1表達(dá)促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞的分化[30]。通過體外培養(yǎng)ⅠCR胎鼠腦皮質(zhì)的神經(jīng)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的miR-34a可使Nestin蛋白表達(dá)量和基因的轉(zhuǎn)錄水平下降，說明miR-34a參與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化可能是通過調(diào)控Nestin表達(dá)來介導(dǎo)[31]。此外，miR-34a調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化扮演著重要的角色，過表達(dá)miR-34a可靶向作用于Syt1和Atg9a參與神經(jīng)干細(xì)胞的分化調(diào)控[32]。值得注意的是，Aranha等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程中，miR-34a的表達(dá)伴隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞的出現(xiàn)，并且在特定的條件下miR-34a過表達(dá)會(huì)促進(jìn)GFAP+細(xì)胞的表達(dá)顯著增加，從而認(rèn)為miR-34a可能參與神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后7 d，大鼠缺血周邊區(qū)miR-34a表達(dá)相對(duì)模型組升高，而在電針干預(yù)后，miR-34a的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，與BrdU+/GFAP+細(xì)胞數(shù)量增加一致，提示電針能夠促進(jìn)缺血再灌注損傷大鼠miR-34a過表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化。已有研究證實(shí)，miR-34a調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化，且可能參與神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的過程[32-33]。因此，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步明確電針是否特異性通過調(diào)控miR-34a促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化，利用miR-34a抑制劑側(cè)腦室干預(yù)后發(fā)現(xiàn)miR-34a抑制劑相對(duì)DMSO溶劑，能夠阻斷電針促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化的效應(yīng)，即缺血周邊區(qū)BrdU+/GFAP+細(xì)胞數(shù)量減少，這些充分表明電針通過調(diào)控miR-34a過表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化致BrdU+/GFAP+細(xì)胞數(shù)量增加。

本研究結(jié)果提示，miR-34a可能參與調(diào)控電針曲池和足三里促進(jìn)缺血周邊區(qū)Nestin+/GFAP+細(xì)胞增殖，且可能促進(jìn)其分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞(BrdU+/GFAP+細(xì)胞)。但是miR-34a作用的靶基因信號(hào)分子的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。