妊娠期慢性疼痛對母鼠認(rèn)知功能影響機制研究*

周 芳 黃 悅 李 清 涂淑敏 劉玉平

（1徐州醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院，徐州 221004； 2北京清華長庚醫(yī)院麻醉科，北京 102218；3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院護理部，徐州 221002）

國際疼痛學(xué)會(International Association for the Study of Pain, IASP)將疼痛定義為一種與組織損傷或潛在組織損傷相關(guān)的感覺、情感、認(rèn)知和社會維度的痛苦體驗。持續(xù)或間歇性持續(xù)3個月以上的疼痛被定義為慢性疼痛(chronic pain,CP)[1]。慢性疼痛持續(xù)時間長，治愈率低，導(dǎo)致病人機體功能失調(diào)，免疫力下降，從而誘發(fā)各種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，增加家庭負擔(dān)，給社會也造成巨大損失[2]。

本課題組前期人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，慢性疼痛可造成孕婦發(fā)生焦慮和抑郁[3]，并導(dǎo)致其產(chǎn)程延長，出血量增加、新生兒Apgar評分較差[4]。在動物實驗中，我們發(fā)現(xiàn)了與人類調(diào)查極為類似的結(jié)果[5,6]。但近期我們在慢性疼痛模型的受孕小鼠中發(fā)現(xiàn)，其認(rèn)知能力（學(xué)習(xí)、記憶）也有顯著下降，且具體機制不明。因此，本研究擬通過構(gòu)建孕期小鼠慢性炎性痛模型，用水迷宮實驗觀測孕鼠認(rèn)知行為，用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)檢測慢性疼痛對孕鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響，并通過實施優(yōu)裕胎教方案對慢性疼痛進行干預(yù)，以揭示妊娠期慢性疼痛對孕鼠認(rèn)知功能影響的機制。

方 法

1.材料

實驗所用動物均為SPF級昆明小鼠，由徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（江蘇）2002-0038。選用未受孕過的雌性小鼠，65～90日齡，25～35 g，同批交配（交配用成年雄性小鼠，25～45 g），10～12 h后發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道涂片發(fā)現(xiàn)精蟲者定為妊娠第 0天。選取40只成功受孕小鼠，隨機分為四組（每組10只）：正常對照組、假手術(shù)對照組、慢性疼痛組、慢性疼痛（下簡稱“慢疼”）+優(yōu)裕胎教組。

2.方法

（1）孕鼠慢性疼痛模型的制備

慢性關(guān)節(jié)炎疼痛模型[5]：母鼠交配成功后當(dāng)日（妊娠第0天），在七氟烷麻醉下，圍繞左后足足跖關(guān)節(jié)部選擇兩點皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑(complete Freund' s adjuvant, CFA) 100 μl (500 μg)，該注射可誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性關(guān)節(jié)炎(chronic arthritis, CA)。在注射后的24 h（妊娠第1天，即疼痛造模第1天）即出現(xiàn)熱和機械痛覺閾值的降低并可維持4周以上，覆蓋母鼠整個孕期（22 d左右）及產(chǎn)后1周。分別在造模后第0、1、3、7、14、21、28 d，用熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。監(jiān)測儀器：IITC series 8, IITC Co., LTD., USA）來評估疼痛，確保動物在各時間點處于相同疼痛水平。假手術(shù)對照組孕鼠用同樣麻醉方式、同樣注射方法、同樣注射部位注入同體積無菌PBS。

（2）飼養(yǎng)方式

常規(guī)飼養(yǎng)方案：單籠單只飼養(yǎng)，鼠籠周圍環(huán)境溫度23±1℃，相對濕度以50%～60%，食物充足，自由攝食飲水，晝夜均衡，直至分娩后3周。

優(yōu)裕胎教飼養(yǎng)方案：將慢性疼痛+優(yōu)裕胎教組孕鼠放置于寬敞的鼠籠中飼養(yǎng)，每籠1只。籠中擺放有云梯、滑繩等供孕鼠啃咬木頭，在常規(guī)飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上還額外提供花生、葵花子、堅果等，同時將小鼠置于節(jié)奏舒緩的音樂中（6 h/d，音量控制在50～60分貝）[7]。

（3）痛相關(guān)遞質(zhì)水平檢測

在母鼠孕第6 d、12 d、18 d、生產(chǎn)當(dāng)日、產(chǎn)后6 d分別用ELISA法檢測其血清中5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)水平。

（4）孕鼠認(rèn)知行為監(jiān)測

Morris 水迷宮水30 cm深，室溫、水溫均保持在(25±1)℃。將水池分為4個象限，將無色透明的平臺固定在第3象限中央，位于水面下1 cm。攝像頭置于水池中央的上方約2 m處，自動采集小鼠游泳軌跡圖像信息并傳入計算機進行分析處理。本研究在給孕鼠造慢性疼痛模型后6～12 d用Morris水迷宮監(jiān)測其認(rèn)知行為狀況，其中定位航行實驗檢測其學(xué)習(xí)能力，空間搜索實驗檢測其記憶能力。

定位航行實驗：歷時6 d。訓(xùn)練第1 d讓小鼠自由游泳以熟悉環(huán)境，上下午各1次，每次時間為60 s。從第2 d起正式檢測，每只小鼠測試4次/天，每次將小鼠面朝池壁輕輕放入水中，記錄小鼠從入水至找到平臺的游泳軌跡及時間（逃避潛伏期，escape latency）。如小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，須將其引至平臺，這時潛伏期計為60 s。取小鼠四次逃避潛伏期的算術(shù)平均數(shù)作為其當(dāng)天的平均逃避潛伏期(average escape latency)。每次訓(xùn)練完，用干毛巾將小鼠擦干（注意避免對其腹部的按壓和刺激），以防止低體溫造成的應(yīng)激，讓小鼠休息60 s后開始下一次訓(xùn)練。

空間搜索實驗：在定位航行試驗結(jié)束后撤除平臺，從第2象限將小鼠放入水中，記錄小鼠60 s內(nèi)搜尋平臺的運動軌跡、在原平臺所在象限的停留時間和游程占總時間（時間比率）和總游程（游程比率）的百分比、平均游速和穿越原平臺區(qū)的次數(shù)。

3.統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。多組間比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用事后檢驗LSD法（資料均符合正態(tài)性和方差齊性）。計數(shù)資料用百分比(%)表示，多組間比較采用卡方檢驗。按檢驗水準(zhǔn)α = 0.05，當(dāng)P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.慢性疼痛對孕鼠認(rèn)知行為的影響

（1）慢性疼痛對孕鼠學(xué)習(xí)能力的影響：定位航行實驗結(jié)果顯示，從訓(xùn)練第3天至第6天，與正常對照組、假手術(shù)對照組和慢疼＋優(yōu)裕胎教組孕鼠相比，慢性疼痛組孕鼠平均逃避潛伏期均較長（P＜ 0.05，見圖1）。

（2）慢性疼痛對孕鼠記憶能力的影響（見表1）。

2.慢性疼痛對孕鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響（見圖2）

與假手術(shù)對照組相比，慢性疼痛組孕鼠在整個孕期與產(chǎn)后6天其外周血中5-HT與DA水平顯著降低（P＜ 0.05，見圖2A、2B）。與慢性疼痛組相比，慢疼＋優(yōu)裕胎教組孕鼠在圍產(chǎn)期各時間點5-HT與DA水平顯著增高（P＜ 0.05，見圖2A、2B）。

討 論

慢性疼痛常伴有認(rèn)知功能的改變，如慢性疼痛病人常主訴學(xué)習(xí)、記憶障礙，近80%的慢性疼痛病人認(rèn)為自己學(xué)習(xí)記憶能力減退[8]。本研究在受孕小鼠慢性疼痛模型中發(fā)現(xiàn)，孕期慢性疼痛可導(dǎo)致孕鼠認(rèn)知能力下降，優(yōu)裕胎教可有效改善其認(rèn)知能力。

當(dāng)疼痛發(fā)生時，沖動信號通過丘腦部分傳遞到大腦皮層，并由中央后回（大腦負責(zé)疼痛感覺的區(qū)域）接收。其他沖動傳遞到腦干的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大腦邊緣系統(tǒng)和廣泛的大腦皮層（包括額葉，頂葉和顳葉），它們進行綜合、分析信號，最終命令身體通過情緒活動和有意識的運動來應(yīng)對疼痛[9]。在這些信號的傳導(dǎo)過程中，介導(dǎo)疼痛的遞質(zhì)如5-HT、DA不僅參與疼痛的調(diào)控[10]，對學(xué)習(xí)記憶也有重要的調(diào)節(jié)作用[11]。5-HT通過軸突投射廣泛釋放到大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)的興奮狀態(tài)，參與人類的認(rèn)知、情緒和運動等許多生理過程[12]。海馬中5-HT與認(rèn)知功能密切相關(guān)，在海馬長時程效應(yīng)增強和記憶改善中起重要作用，是維持智力的重要神經(jīng)遞質(zhì)[13]。DA 可以減少氧化應(yīng)激損傷，增加腦部血流供應(yīng)，改善腦部神經(jīng)元利用葡萄糖，在突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶形成的調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨認(rèn)知能力的下降，慢性疼痛組孕鼠5-HT、DA遞質(zhì)水平從孕6天開始逐漸降低，生產(chǎn)當(dāng)日達到最低水平，產(chǎn)后有所增高。與假手術(shù)對照組相比，慢性疼痛組孕鼠5-HT、DA水平顯著降低。而優(yōu)裕環(huán)境下飼養(yǎng)的慢性疼痛孕鼠，其認(rèn)知能力與慢性疼痛組孕鼠相比有顯著改善，同時各時間點其5-HT、DA水平與慢性疼痛組孕鼠相比亦顯著增高。這提示5-HT和DA可能是慢性疼痛導(dǎo)致孕鼠認(rèn)知能力下降的機制之一。

表1 各組孕鼠空間搜索能力比較 (n = 6,±SD)Table 1 Comparison of spatial search ability of pregnant mice in each group (n = 6,±SD)

表1 各組孕鼠空間搜索能力比較 (n = 6,±SD)Table 1 Comparison of spatial search ability of pregnant mice in each group (n = 6,±SD)

*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，與假手術(shù)對照組比較；△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，與慢性疼痛組比較*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001, compared with the sham group; △ P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01, compared with the CP group.

穿越平臺次數(shù)Number of crossing the platform(times/60s)游速Swimming speed（cm/s）時間比率Time ratio(%)游程比率Distance ratio(%)正常對照組Normal 4.61±1.33 21.32±1.20 42.93±3.27 46.28±2.92假手術(shù)對照組Sham 4.69±1.69 22.17±1.99 41.64±3.36 43.53±3.59慢性疼痛組CP 1.24±1.35** 19.42±1.52* 25.33±3.83*** 26.69±2.67**慢疼+優(yōu)裕胎教組CP + EEI 3.32±1.56△ 20.27±1.66 34.39±2.57△△ 36.82±3.39△△

圖2 (A)各組孕鼠在不同時間點5-HT水平的比較; (B)各組孕鼠在不同時間點DA水平的比較aP ＜ 0.05，與正常對照組比；bP ＜ 0.05，與假手術(shù)對照組比；cP ＜ 0.05，與慢性疼痛組比Fig.2 (A) Comparison of 5-HT level of pregnant mice in each group at different time points.(B) Comparison of DA level of pregnant mice in each group at different time points aP ＜ 0.05, compared with the normal group; bP ＜ 0.05, compared with the sham operation group; cP ＜ 0.05, compared with CP group.

本項目的完成揭示了妊娠期慢性疼痛對母體認(rèn)知功能產(chǎn)生不利影響的機制并提供了干預(yù)策略，為臨床患有慢性疼痛的孕婦的無創(chuàng)、非藥物性干預(yù)提供了實踐依據(jù)，為改善分娩結(jié)局，提高出生人口素質(zhì)，促進母嬰健康提供了有力支持。