p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體在胃癌組織中的表達及其對胃癌細胞侵襲的影響

董勝肖，靳海峰#，陳連剛，劉爽，劉惠敏，劉文格，劉貞

解放軍白求恩國際和平醫(yī)院1消化內(nèi)科，2呼吸科，3腫瘤科，4病理科，石家莊 0500820

p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體（neurotrophin receptor，NTR）是由399個氨基酸組成的I型細胞跨膜糖蛋白，其分布較為廣泛，表達于多種細胞的表面，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和免疫系統(tǒng)的中性粒細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等[1]。目前，關(guān)于p75NTR在腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為中的作用尚存在爭議。國外有研究顯示，p75NTR具有類抑癌基因的活性，可以通過抑制腫瘤細胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，從而抑制膀胱癌和前列腺癌的生長[2-3]。但是，國內(nèi)也有研究認(rèn)為，p75NTR可以促進喉癌細胞的增殖活性，并且與喉癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、分化等密切相關(guān)[4]。本研究探討了p75NTR在胃癌組織中的表達情況及其對胃癌細胞侵襲能力的影響，并分析其在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用，旨在為臨床胃癌靶向治療藥物的研發(fā)提供新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2015年10月至2016年8月于解放軍白求恩國際和平醫(yī)院行手術(shù)切除的胃癌患者的胃癌組織標(biāo)本及其相應(yīng)的癌旁（距腫瘤組織邊緣≥5 cm）正常組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為胃癌；②胃癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本均來源于手術(shù)后；③術(shù)前均未行放化療；④臨床資料完整；⑤存在明確的TNM分期和組織分化程度。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性胃癌；②有腫瘤相關(guān)治療史。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共選取80例胃癌患者的胃癌組織（每例患者僅取一份病理組織）標(biāo)本和相應(yīng)的80例癌旁正常組織標(biāo)本。80例胃癌患者中，男49例，女31例；年齡為22～78歲，平均年齡為（59.18±10.64）歲；組織分化程度：中+高分化56例，低+未分化24例；TNM分期按照國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）和美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）頒布的第7版胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)[5]進行分期：I期11例，Ⅱ期27例，Ⅲ期34例，Ⅳ期8例。

1.2 細胞、試劑與儀器

利用胃癌患者的活檢組織進行體外細胞培養(yǎng)，獲得胃癌細胞株。免疫組化SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司，ECL Western blot檢測試劑盒購自美國Amersham公司，超凈工作臺購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，CO2培養(yǎng)箱購自上海喬躍電子科技有限公司，核酸蛋白檢測儀購自上海嘉鵬科技有限公司，光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司，電轉(zhuǎn)移儀購自美國Bio-Rad公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Promega公司，總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）特異性定量引物、內(nèi)參均購自大連Takara公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 在無菌條件下，取新鮮的胃癌組織標(biāo)本放入離心管，保存于4℃溫度下。將切成碎塊的胃癌組織置于無菌培養(yǎng)皿中，加入2 ml 0.25%胰蛋白酶，孵育30 min，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后獲得單細胞懸液，加入紅細胞裂解液，裂解細胞；1000 r/min離心5 min，離心半徑為19 cm，棄除上清液，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，將細胞置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24～48 h更換培養(yǎng)液，48 h傳代1次。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色法 取石蠟包埋組織進行切片，切片厚度為1～2 μm，嚴(yán)格按照免疫組化SP試劑盒說明書的步驟進行操作。每個切片隨機選擇10個視野，觀察p75NTR的陽性表達情況。p75NTR陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細胞膜和細胞質(zhì)呈棕黃色顆粒判定為p75NTR陽性表達。①染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；計算10個視野下的染色平均分值。②陽性細胞所占百分比評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，陽性細胞所占百分比為0；1分，陽性細胞所占百分比為1%～10%；2分，陽性細胞所占百分比為11%～50%；3分，陽性細胞所占百分比為51%～75%；4分，陽性細胞所占百分比＞75%。根據(jù)染色指數(shù)判定染色結(jié)果，染色指數(shù)=陽性細胞所占百分比評分×細胞染色強度評分；其中，染色指數(shù)為0～1分為p75NTR陰性表達，染色指數(shù)≥2分為p75NTR陽性表達[6]。

1.3.3 細胞轉(zhuǎn)染及分組 ①構(gòu)建慢病毒干擾載體：從GenBank中獲得編碼人p75NTR基因（NM-003483）的序列；選擇pGMLV-綠色熒光蛋白基因（green fluorescence protein gene，GFP）慢病毒載體，構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細胞DH5α中。采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取慢病毒重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至293T細胞中，測定慢病毒滴度。②建立p75NTR基因過表達穩(wěn)定細胞系：提前1天在相應(yīng)備行轉(zhuǎn)染的6孔板上接種5×105個細胞，培養(yǎng)24 h后，待細胞融合度達50%～60%時，嚴(yán)格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書的步驟將p75NTR序列或無序序列轉(zhuǎn)染至細胞，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。提取細胞RNA及蛋白，驗證目的基因的表達情況及轉(zhuǎn)染效率。將胃癌細胞分為兩組：陰性對照（NC）組（轉(zhuǎn)染無序序列）和p75NTR轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染p75NTR序列）。

1.3.4 RT-PCR檢測細胞中p75NTRmRNA的表達情況 按照總RNA提取試劑操作說明提取胃癌細胞的總RNA。以上述提取的總RNA中的mRNA作為模板，按照mRNA逆轉(zhuǎn)錄說明書將所提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃的條件中備用。將25 μl反應(yīng)體系（Taq Mix22 μl+cDNA模板1 μl+上下游引物各1 μl）按程序擴增：95 ℃ 3 min預(yù)變性；95℃ 30 s變性，60℃ 30 s退火（U6、p75NTR退火溫度分別為60℃、57.8℃），72℃5 min延伸，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，進行RT-PCR檢測。U6上游引物為5'-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3'，下游引物為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；p75NTR上游引物為5'-CAGCTTTGAGGTTCGTGTTTGT-3'， 下 游 引 物 為 5'-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA-3'。實驗重復(fù)3次。根據(jù)熒光定量PCR儀的使用說明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機陰性對照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值），應(yīng)用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.3.5 Transwell小室檢測細胞的侵襲能力 將誘導(dǎo)分化后的胃癌原代細胞（每孔1×105個細胞）100 μl單層接種至Transwell上層小室內(nèi)，加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基；下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液；將Transwell小室置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。于下室中加入足量的甲醛固定液，結(jié)晶紫染色，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次，置于倒置光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。顯微鏡下隨機選取5個視野觀察侵襲細胞數(shù)目，每個視野計數(shù)3次，取平均值。實驗重復(fù)3次。

1.3.6 細胞黏附實驗 在96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μl Matrigel膠，4℃預(yù)冷過夜。加入含5%胎牛血清的PBS室溫孵育30 min，調(diào)整細胞濃度，以每孔1×105個細胞接種至96孔板中，加入含0.1%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育45 min后，棄上清，每孔加入100 μl含0.2%Cristal viole（t75%乙醇配制），室溫染色15 min后，PBS沖洗細胞2次，干燥。每孔加入100 μl含5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的50%乙醇裂解細胞，靜置30 min后，測定540 nm波長處的吸光度值。實驗重復(fù)3次。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細胞中p75NTR蛋白的表達情況 將細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液倒掉，加入苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）細胞裂解液，提取細胞總蛋白。加入SDS上樣緩沖液充分混勻，置于95℃水浴箱中10 min，使蛋白變性。進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳分離，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。浸入密封液中，室溫密閉1 h。加入p75NTR抗體（1∶1000稀釋）孵育過夜。采用TBST液沖洗3次，加入二抗，37℃孵育1 h，取適量的ECL試劑顯影5 min，采用凝膠成像分析系統(tǒng)測定凝膠光密度值。采用Western blot檢測p75NTR蛋白表達水平的變化。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對-數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p75NTR蛋白在胃癌組織中的表達情況

免疫組化染色結(jié)果顯示：胃癌組織中p75NTR蛋白的陽性表達率為26.25%（21/80），明顯低于癌旁正常組織的73.75%（59/80），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=36.100，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征的胃癌患者p75NTR蛋白表達情況

腫瘤直徑＜5 cm、TNM分期為I～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者胃癌組織中的p75NTR蛋白陽性表達率均高于腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同年齡、性別、分化程度胃癌患者胃癌組織中的p75NTR蛋白的陽性表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的胃癌患者p75NTR陽性表達情況比較

2.3 轉(zhuǎn)染后胃癌細胞中p75NTR蛋白和p75NTR mRNA相對表達量的比較

經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測，結(jié)果顯示，p75NTR轉(zhuǎn)染后，NC組胃癌細胞中p75NTRmRNA的相對表達量為（0.42±0.10），低于p75NTR轉(zhuǎn)染組胃癌細胞中的（1.39±0.11），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.972，P＜0.05）。NC組胃癌細胞中p75NTR蛋白的相對表達量為（0.37±0.09），低于p75NTR轉(zhuǎn)染組胃癌細胞中的（2.25±0.14），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=32.594，P＜0.05）。

2.4 p75NTR過表達對胃癌細胞黏附能力和侵襲能力的比較

p75NTR轉(zhuǎn)染組胃癌細胞的黏附率為（27.85±6.114）%，低于NC組的（100.0±10.35）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.976，P＜0.05）。p75NTR轉(zhuǎn)染組胃癌細胞的侵襲率為（20.98±4.33）%，低于NC組的（100.0±6.79）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=27.754，P＜0.05）。

3 討論

胃癌發(fā)展至一定程度后便會發(fā)生轉(zhuǎn)移，多數(shù)早期胃癌患者的臨床癥狀缺乏特異性，且胃癌的病程較短，惡化程度較高，大部分胃癌患者確診時已表現(xiàn)出明顯的胃癌轉(zhuǎn)移的癥狀，并很快出現(xiàn)惡病質(zhì)[7]。胃癌的轉(zhuǎn)移途徑較多，胃癌患者的情況不同，胃癌的轉(zhuǎn)移途徑亦不同。左鎖骨上淋巴結(jié)、肝臟、腹腔轉(zhuǎn)移均是胃癌的最常見轉(zhuǎn)移途徑；胃癌發(fā)生腹腔廣泛轉(zhuǎn)移時患者可出現(xiàn)腹腔積液的癥狀，發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移時患者可出現(xiàn)肝腫大及相關(guān)癥狀。研究顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，而且發(fā)生較早[8]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占胃癌轉(zhuǎn)移的70%；胃下部腫瘤常轉(zhuǎn)移至幽門下淋巴結(jié)、胃下淋巴結(jié)、腹腔動脈旁淋巴結(jié)等，而胃上部腫瘤常轉(zhuǎn)移至胰旁淋巴結(jié)、賁門旁淋巴結(jié)、胃上淋巴結(jié)等[9]。晚期胃癌可轉(zhuǎn)移至主動脈周圍和膈上淋巴結(jié)，甚至可轉(zhuǎn)移至左鎖骨上淋巴結(jié)。隨著腫瘤的生長，腫瘤侵犯胃壁越深、越廣，發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險就越大。根據(jù)轉(zhuǎn)移的先后順序?qū)⑽赴┺D(zhuǎn)移分為3組：第1組，距離瘤體最近且貼于胃壁上的淺組淋巴結(jié)，一般發(fā)生于胃癌局限于黏膜下層時[8]；第2組，引流淺淋巴結(jié)的深組淋巴結(jié)，發(fā)生于胃癌侵犯黏膜肌層時；第3組，包括腹腔動脈旁、腹主動脈、肝門、腸系膜根部及結(jié)腸中動脈周圍淋巴結(jié)，也可發(fā)生遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，如左鎖骨上淋巴結(jié)，此組轉(zhuǎn)移多為腫瘤侵犯至漿膜層時發(fā)生[10]。發(fā)生第3組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，胃癌患者已經(jīng)失去了根治的機會。

胃癌的直接轉(zhuǎn)移指的是腫瘤生長并侵入胃壁后，可繼續(xù)向縱深方向生長，突破漿膜層，直接侵犯相鄰器官和組織（以大網(wǎng)膜、肝、胰、橫結(jié)腸為常見，其次為空腸、膈肌甚至腹壁）[11]。胃癌轉(zhuǎn)移直接關(guān)系到手術(shù)方式的選擇及是否能夠行根治性切除。一般僅存在鄰近臟器局限性轉(zhuǎn)移時，可行手術(shù)切除，但是若轉(zhuǎn)移范圍較大，則難以行根治性手術(shù)切除。浸潤型胃癌可沿黏膜或漿膜直接向食管或十二指腸發(fā)展。腫瘤一旦侵及漿膜，極容易向周圍鄰近器官或組織如肝、胰、脾、橫結(jié)腸、空腸、膈肌大網(wǎng)膜及腹壁等浸潤。腫瘤細胞脫落時，也可種植于腹腔、盆腔、卵巢與直腸膀胱陷凹等位置[11]。

近年來，研究證實，p75NTR對于部分腫瘤的發(fā)展具有抑制作用，被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤抑制劑[12]。研究顯示，p75NTR對前列腺癌的生長具有明顯的抑制作用[13]；但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR對黑色素瘤細胞的腦轉(zhuǎn)移具有促進作用[14]。兩項研究的結(jié)論存在矛盾，提示p75NTR發(fā)揮的作用并不是固定的，可能會因環(huán)境與腫瘤的不同而發(fā)揮不同的作用[15]。本研究先通過Western blot檢測p75NTR在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達情況，探討了不同臨床特征胃癌患者p75NTR的陽性表達情況，又觀察了p75NTR表達對胃癌細胞侵襲細胞外基質(zhì)的能力和黏附能力的影響，結(jié)果顯示，p75NTR蛋白在胃癌組織中的陽性表達率為26.25%，明顯低于癌旁正常組織的73.75%（P＜0.01），而且上調(diào)p75NTR的表達后，胃癌細胞的黏附率和侵襲率均降低，表明過表達p75NTR對胃癌細胞的侵襲和黏附能力均具有抑制作用，提示p75NTR可能在胃癌的發(fā)生過程中起著重要作用。

綜上所述，p75NTR在胃癌組織中的陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期為I～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者胃癌組織中的p75NTR陽性表達率均較高，且能夠抑制胃癌細胞的侵襲能力和黏附能力，對于臨床上靶向治療胃癌具有一定的參考意義。