骨肉瘤患者的個(gè)體化療與藥敏相關(guān)基因的臨床研究

龍作堯 魯亞杰 李明輝 肖鑫 王臻

作者單位：710032 西安，空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科

骨肉瘤是兒童和青少年間最常見(jiàn)的惡性原發(fā)性骨腫瘤。骨肉瘤大約有 80% 發(fā)生在四肢長(zhǎng)骨，尤其是在股骨遠(yuǎn)端、肱骨近端和脛骨近端，20% 發(fā)生在中軸骨和骨盆。現(xiàn)行的骨肉瘤臨床治療標(biāo)準(zhǔn)建立于20 世紀(jì) 80 年代，主要包括術(shù)前化療、手術(shù)和術(shù)后化療；在現(xiàn)今的新輔助化療中，一線藥物主要包括異環(huán)磷酰胺、鉑類、阿霉素和甲氨蝶呤[1]。但是在臨床應(yīng)用的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，患者易產(chǎn)生化療耐藥性，導(dǎo)致化療失敗，其主要表現(xiàn)為復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，如何提高骨肉瘤的化療效果，成為骨肉瘤治療的首要問(wèn)題[2]。腫瘤的異質(zhì)性導(dǎo)致不同患者對(duì)同種化療藥物的反應(yīng)不同，所以提高治療預(yù)后最有效的途徑是避免無(wú)效化療。

有研究通過(guò)對(duì)肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌的全基因測(cè)序，確定了大量的基因突變；“細(xì)胞致癌作用和腫瘤異質(zhì)性主要是由于基因信息的改變”這一觀點(diǎn)[3]，也得到了學(xué)術(shù)界的廣泛認(rèn)可。高通量測(cè)序可以快速準(zhǔn)確地對(duì)大量基因進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)許多與化療敏感性和細(xì)胞毒性相關(guān)的基因突變和基因多態(tài)性；通過(guò)實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)，可以檢測(cè)基因表達(dá)程度[4]。例如 ERCC1 基因的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致鉑類耐藥[5]；CYP2C9 的基因多態(tài)性會(huì)影響異環(huán)磷酰胺的敏感性[6]。然而這些基因在臨床中的化療效果與檢測(cè)結(jié)果是否相同，還有待研究。

資料與方法

一、納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 我院 2011 年 1 月 1 日至 2017年 12 月 31 日收治的患者；( 2 ) 經(jīng)過(guò)病理確診為骨肉瘤者；( 3 ) 簽署知情同意書者。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 病理診斷不明確者；( 2 ) 術(shù)前未完成 4 次新輔助化療者；( 3 ) 不能遵醫(yī)囑定期化療者；( 4 ) 拒絕化療者；( 5 ) 拒絕簽署知情同意書者。

本研究共納入 38 例，男 18 例，女 20 例，平均年齡 16.32 歲。病變部位分布為股骨遠(yuǎn)端 25 例，脛骨近端 9 例，肱骨遠(yuǎn)端 2 例，髖骨 1 例，鎖骨遠(yuǎn)端1 例，病理學(xué)診斷結(jié)果均為普通型骨肉瘤。本項(xiàng)研究已通過(guò)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)證 ( 表 1 )。

二、樣本收集

患者行病理活檢同時(shí)獲得腫瘤軟組織作為檢測(cè)樣本。將取得的樣本剪切成直徑為 3～5 mm 的碎片，置于液氮保存。

三、骨肉瘤藥敏相關(guān)基因的選擇

本研究分析所選擇的腫瘤基因，均已通過(guò)先前的研究證實(shí)與化療藥物的代謝有關(guān)。筆者查閱了 PubMed、Medline、萬(wàn)方醫(yī)學(xué)、知網(wǎng)醫(yī)學(xué)等文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，選取了與臨床一線化療藥物代謝相關(guān)的11 個(gè)基因進(jìn)行分析，包括：異環(huán)磷酰胺相關(guān)基因CYP2C9*3[7]；鉑類相關(guān)基因 ERCC1、BRCA1、XRCC1、GSTP1、MRP2[8]，以及阿霉素相關(guān)基因TOP2A、ABCB1、GSTM1、GSTT1 等[9]。部分基因參與 DNA 修復(fù)，如 ERCC1、BRCA1、XRCC1；部分基因編碼酶蛋白，參與生化反應(yīng)，如 GSTP1、GSTM1、GSTT1；其它基因通過(guò)參與藥物催化或物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，在骨肉瘤化療中發(fā)揮作用。

表1 患者基線、化療結(jié)局及基因敏感性Tab.1 Characteristics, prognosis and ef ficacy

1. 基因檢測(cè)：基因 mRNA 表達(dá)水平選用實(shí)時(shí)定量 PCR ( Real time PCR ) 檢測(cè)方法，使用 ABI 熒光定量試劑盒，通過(guò) ABI 7500 熒光定量 PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)；基因突變和基因多態(tài)性選用 DNA 測(cè)序、ARMS法，使用 ABI PCR 測(cè)序試劑盒和 ABI 熒光定量試劑盒，通過(guò) ABI 3730XL DNA 測(cè)序儀、ABI 7500 熒光定量 PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)。

2. 化療效果評(píng)估：化療效果臨床評(píng)估包括：疼痛 ( NRS 疼痛數(shù)字評(píng)價(jià)量表 )、腫瘤大小、腫瘤邊界是否清晰及腫瘤內(nèi)部是否出現(xiàn)鈣化等。評(píng)估結(jié)果主要分為三級(jí)，即緩解、穩(wěn)定與進(jìn)展。緩解：患者疼痛減輕，腫瘤邊界清晰、大小無(wú)增加，腫瘤區(qū)域出現(xiàn)鈣化或鈣化增多；穩(wěn)定：疼痛減輕或無(wú)明顯變化，腫瘤邊界叫化療前無(wú)變化、大小無(wú)增加；進(jìn)展：疼痛加重，腫瘤邊界模糊不清、大小增加，腫瘤區(qū)域沒(méi)有鈣化。另外，腫瘤在化療過(guò)程中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，也歸為進(jìn)展。緩解和穩(wěn)定表示化療有效，進(jìn)展則表示化療無(wú)效[10]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用 SPSS 18.0 軟件分析。若總樣本量＜40 或表 1～4 中有數(shù)據(jù)期望頻數(shù)＜1，則使用 Fisher精確檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、新輔助化療方案

所有患者均接受異環(huán)磷酰胺、鉑類＋阿霉素循環(huán)兩周期的化療方案 ( 表 1 )。叮囑患者化療期間若出現(xiàn)白細(xì)胞降低等不良反應(yīng)，及時(shí)就診，待癥狀消失后繼續(xù)化療。

二、化療敏感性檢驗(yàn)

根據(jù)研究所選取的 11 個(gè)基因突變和基因表達(dá)，筆者制訂了評(píng)估多種藥物敏感性的標(biāo)準(zhǔn) ( 包括異環(huán)磷酰胺、鉑類和阿霉素，表 2 )，其核心是不同基因表達(dá)程度和突變情況的綜合。檢測(cè) mRNA 表達(dá)水平的基因包括 ERCC1、BRCA1、TOP2A 等，檢測(cè)基因突變或基因多態(tài)性的基因包括 CYP2C9*3、ABCB1、XRCC1、GSTP1、MRP2、GSTT1 及 GSTM1 等。

三、化療敏感性評(píng)估

3 例僅對(duì)一種藥敏感，20 例對(duì)兩種藥敏感，15 例對(duì)三種藥均敏感 ( 表 1 )?；颊邔?duì)異環(huán)磷酰胺、鉑類、阿霉素的敏感率分別為 89.5% ( 34 / 38 )、81.6% ( 31 / 38 )、57.9% ( 22 / 38 )，而且明顯高于阿霉素 (P＜0.05 ) ( 表 3 )。

四、化療效局

24 例化療有效，14 例化療無(wú)效 ( 表 1 )。

其中基因檢測(cè)僅對(duì)單種藥敏感的患者臨床化療有效率為 0% ( 0 / 3 )，對(duì)任意兩種藥敏感的患者為 70%( 14 / 20 )，三藥敏感者為 66.7% ( 10 / 15 ) ( 表 4 )。

五、個(gè)案分析

1. 患者，男，19 歲，右側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨肉瘤：患者基因敏感性為三藥均敏感，化療結(jié)局為緩解。

患者化療前查體發(fā)現(xiàn)：右側(cè)大腿下段及膝關(guān)節(jié)明顯腫脹，可觸及大小約 12 cm×6 cm×4 cm 質(zhì)硬包塊，邊界不清，活動(dòng)度差；髕骨上極上方 5 cm 處肢體周徑左 / 右＝33 cm / 42 cm。NRS 評(píng)分 3 分。2016-05-08 行右股骨遠(yuǎn)端病變穿刺活檢，病理回報(bào)骨肉瘤。

經(jīng)過(guò) 4 次術(shù)前化療后，患者自感包塊減小，NRS 評(píng)分 0 分?；熐芭c化療后 X 線比較發(fā)現(xiàn)，化療后包塊明顯縮小，腫瘤邊界變清，瘤內(nèi)鈣化灶增多 ( 圖 1 ) 。

2. 患者，女，9 歲，左股骨遠(yuǎn)端骨肉瘤：患者基因敏感性為單藥敏感，化療結(jié)局為進(jìn)展?；颊哂?017 年 7 月無(wú)明顯誘因發(fā)現(xiàn)左大腿內(nèi)側(cè)包塊，局部疼痛，間斷性發(fā)作，有夜間痛，行左股骨遠(yuǎn)端病變穿刺活檢，術(shù)后病理報(bào)普通型骨肉瘤。后給予順鉑＋阿霉素、異環(huán)磷酰胺交替化療 4 次，化療后患者感疼痛基本消失，包塊較前增大。比較化療 1 個(gè)月前后 X 線片結(jié)果可看出，經(jīng)過(guò)化療后骨膜反應(yīng)更加明顯，骨質(zhì)破壞也更嚴(yán)重；包塊較前增大，腫瘤邊界模糊不清，瘤內(nèi)鈣化灶無(wú)變化 ( 圖 2 )。

討 論

骨肉瘤是一種有侵略性的惡性原發(fā)性骨腫瘤，好發(fā)于青少年；年齡＜20歲的骨腫瘤患者中，有60% 是骨肉瘤；未接受化療的骨肉瘤患者中，有80% 發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。因此，有效的化療對(duì)于骨肉瘤患者的生存率是至關(guān)重要的?，F(xiàn)有的骨肉瘤化療方案都是通過(guò)各個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果得出的，并沒(méi)有完全反映腫瘤的異質(zhì)性。換言之，不同的人對(duì)不同化療藥物的敏感性是不同的 ( 表 1、2 )。因此對(duì)于這種異質(zhì)性腫瘤來(lái)說(shuō)，個(gè)體化信息的研究和治療方法是必要的。在本次研究中，對(duì)所有患者施行統(tǒng)一的化療方案，通過(guò)分析基因化療敏感性和臨床化療結(jié)局之間的關(guān)系，希望通過(guò)基因敏感性來(lái)指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療[11]。

表2 38 例骨肉瘤患者化療敏感性相關(guān)基因表達(dá)與突變分析Tab.2 Analysis of chemosensitivity-related gene expressions and mutations in 38 osteosarcoma patients

基因的敏感性主要取決于基因的表達(dá)、突變或基因多態(tài)性。

一、異環(huán)磷酰胺相關(guān)基因

CYP2C9 基因具有基因多態(tài)性，除野生型CYP2C9*1 以外，CYP2C9 基因編碼區(qū)至少有 32 種單核苷酸多態(tài)性，編碼不同的異型酶。CYP2C9*3 就是其中之一。CYP2C9*3 反映了氨基酸序列中的一種Ile359-Leu ( I359L，A→C ) 突變型，其催化活性與野生型相比較低，會(huì)減慢藥物的代謝。由于異環(huán)磷酰胺只有在被水解為異磷酰胺氮芥時(shí)，才會(huì)發(fā)揮抗癌作用。因此，CYP2C9*3 突變型細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致異環(huán)磷酰胺在體內(nèi)滯留時(shí)間延長(zhǎng)，降低對(duì)異環(huán)磷酰胺的敏感性[12]。

表3 不同藥物的基因敏感性Tab.3 Chemosensitivity of different agents

表4 基因敏感性與化療有效性的比較Tab.4 Comparison of chemosensitivity and ef ficacy

二、鉑類相關(guān)基因

細(xì)胞對(duì)抗鉑類藥物的耐藥由多種機(jī)制共同作用，大體包括 3 個(gè)方面：( 1 ) 細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度下降，增加藥物泵出，減少藥物攝取和藥物失活增加，都會(huì)導(dǎo)致有效濃度降低；( 2 ) 細(xì)胞修復(fù) DNA 損傷能力的提高；( 3 ) DNA 損傷介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑異常。

ERCC1 和 BRCA1 基因都是 DNA 修復(fù)基因，當(dāng)基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，兩種基因會(huì)通過(guò)不同的方式增強(qiáng)DNA 修復(fù)能力，從而拮抗鉑類藥物的作用[8]。

XRCC1 基因可以參與 DNA 堿基切除修復(fù)通路修復(fù) DNA，其外顯子 6 和 10 ( exon6，exon10 ) 有單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphism，SNP )。Exon 6 易發(fā)生突變的非保守位點(diǎn)為 Arg194Trp( C→T )，其中 Arg194Arg 基因型的化療敏感性明顯低于其它兩種基因型，因此可以推測(cè) 194Trp 基因可能是患者化療的獲益基因；Exon 10 易發(fā)生突變的非保守位點(diǎn)為 Arg399Gln ( G→A )，其中 Arg399Arg基因型的化療敏感性明顯高于其它兩種，因此Arg399Arg 可能是患者化療的獲益基因[13]。

GSTP1，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶，是一類可以通過(guò)催化疏水和親電子的化合物與還原型谷胱甘肽結(jié)合，從而達(dá)到解毒作用的酶。其外顯子 5 的多態(tài)性表現(xiàn)為第 81 位點(diǎn) A→G 堿基替代，可導(dǎo)致肽鏈第105 位氨基酸由 ATC ( 異亮氨酸，Ile ) 變?yōu)?GTC ( 纈氨酸，Val )。臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)顯示，Val105Val基因型的鉑類化療藥物敏感性明顯高于其它兩種基因型，說(shuō)明這種基因表型可以使鉑類藥物的外排降低，在體內(nèi)積存增加，從而使患者對(duì)鉑類化療敏感性提高[14]。

MRP2，多耐藥相關(guān)蛋白 2，是一種跨膜蛋白，不僅可以代謝內(nèi)源性物質(zhì)，也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)藥物、毒物及其代謝產(chǎn)物的濃度，從而影響藥物生物利用度和體內(nèi)分配。MRP2 的 SNP 有 6 種，其中C24T、G1249A、C3972T 最常見(jiàn)。臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，僅位于第 10 外顯子的 G1249A 突變，會(huì)影響鉑類化療的敏感性。發(fā)生 G1249A 突變時(shí)，其表達(dá)產(chǎn)物中第 417 位氨基酸相應(yīng)地從纈氨酸 Val 變?yōu)楫惲涟彼?Ile，使腫瘤患者對(duì)鉑類化療藥物的敏感性增加。而且，當(dāng) MRP2 表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，鉑-DNA 復(fù)合物形成減少，腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類的耐藥增強(qiáng)；另外MRP2 也可能通過(guò)促進(jìn) GSH 結(jié)合的鉑離子排出細(xì)胞外來(lái)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類的耐藥性[15]。

三、阿霉素相關(guān)基因

TOP2A 基因可以編碼 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶 IIα，這種酶可以在 DNA 轉(zhuǎn)錄的時(shí)候控制和改變 DNA 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。由于蒽環(huán)類藥物可以與 DNA 發(fā)生聯(lián)結(jié)，主要通過(guò)抑制 TOP2A 使 DNA-TOP2A 復(fù)合物處于穩(wěn)定狀態(tài)，因此 TOP2A 是其重要靶酶之一。所以檢測(cè) TOP2A 基因的狀態(tài)有可能用來(lái)評(píng)估患者對(duì)蒽環(huán)類藥物的敏感性。TOP2A 基因擴(kuò)增和 ( 或 ) mRNA、蛋白的過(guò)表達(dá)可以使蒽環(huán)類藥物療效增加，反之抑制TOP2A 低表達(dá)導(dǎo)致蒽環(huán)類藥物耐藥[5]。

ABCB1 基因可以編碼 ATP 結(jié)合盒亞家族 B 成員 1，也稱為 P 糖蛋白 1 ( P-glycoprotein 1，P-gp )，是細(xì)胞膜上把外源性物質(zhì)泵出細(xì)胞的重要蛋白。ABCB1 存在單核苷酸多態(tài)性，與阿霉素耐藥有關(guān)的突變?yōu)?C3435T ( 同義突變 )。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，CT / TT基因型的腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素等化療藥物的敏感性明顯優(yōu)于 CC 基因型[16]。

GSTM1 與 GSTT1 均是谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的一種，可以通過(guò)于還原型谷胱甘肽結(jié)合，對(duì)親電子物質(zhì)發(fā)揮解毒作用，包括致癌物質(zhì)，治療藥物以及環(huán)境毒物等。當(dāng)基因?yàn)榉侨笔?( + ) 時(shí)，其腫瘤細(xì)胞的解毒作用更強(qiáng)，會(huì)降低化療藥物的療效，因此腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生耐藥性[17-18]。

已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了各種基因的表達(dá)與骨肉瘤化療敏感性的關(guān)系。張樂(lè)寧等[19]通過(guò)觀察骨肉瘤細(xì)胞 MG-63 在放化療的作用下，BRCA1 表達(dá)水平對(duì)腫瘤增殖、侵襲、細(xì)胞周期和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)放化療可抑制細(xì)胞增殖和 BRCA1 基因的表達(dá)；張晉煜等[20]通過(guò)分析骨肉瘤患者的 ERCC1 基因的單核苷酸多態(tài)性，證明 ERCC1 第 118 位氨基酸突變與無(wú)病生存率 ( SFS ) 相關(guān)；孫仁光等[21]研究發(fā)現(xiàn)，P-gp的表達(dá)同阿霉素耐藥，GSTP 表達(dá)同阿霉素、順鉑、絲裂霉素耐藥性呈顯著正相關(guān)，且 GSTP 高表達(dá)與骨與軟組織肉瘤耐藥有直接關(guān)系，且影響預(yù)后。

通過(guò) mRNA 表達(dá)的分析和基因檢測(cè)，38 例骨肉瘤患者中異環(huán)磷酰胺的基因敏感率最高，阿霉素最低 ( 表 3 )。臨床化療結(jié)果顯示，對(duì)多種藥物敏感( 兩種或三種 ) 的患者化療有效率明顯高于僅對(duì)單種藥物敏感的患者 (P＝0.043 )。基于患者基因化療敏感性和臨床化療結(jié)局的分析，可以假設(shè)由于大多數(shù)患者的基因化療敏感性不高，使得只有少部分患者得到了有效的化療，從而降低了骨肉瘤患者的化療有效率。術(shù)前的無(wú)效化療不僅不能控制病情，反而使病程繼續(xù)進(jìn)展，導(dǎo)致腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移甚至死亡。

總之，筆者通過(guò)檢測(cè) mRNA 的表達(dá)程度和基因突變或多態(tài)性，判斷患者對(duì)化療藥物的敏感程度，與患者臨床化療結(jié)局作對(duì)比，認(rèn)為基因?qū)Χ喾N化療藥物敏感的患者，其臨床化療效果要優(yōu)于單個(gè)藥物敏感的患者。但是對(duì)于敏感性較差患者的化療方案該如何調(diào)整，還有待后續(xù)研究。而且此次研究樣本量較少，可信度較低，需要更大樣本的研究來(lái)提高可信度。