實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜法對碧螺春紅茶香氣物質(zhì)的快速鑒別

張麗，劉騰飛，劉明，段曉琨，董明輝，*

（1.蘇州市職業(yè)大學(xué)，江蘇蘇州215104；2.蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇蘇州215155；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；4.華質(zhì)泰科生物技術(shù)（北京）有限公司，北京100101）

近年來，隨著蘇州地區(qū)茶葉消費(fèi)的興起和消費(fèi)群體的日趨龐大，自產(chǎn)碧螺春綠茶供不應(yīng)求，同時(shí)，蘇州碧螺春茶區(qū)以綠茶生產(chǎn)為主，生產(chǎn)季節(jié)多限于春季生產(chǎn)，造成優(yōu)質(zhì)的夏秋鮮葉資源的浪費(fèi)，也直接降低了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[1]。因此合理利用蘇州洞庭山地區(qū)鮮葉加工成紅茶不僅可以很好地滿足市場需求，還可以充分開發(fā)當(dāng)?shù)夭铇漉r葉資源，豐富蘇州洞庭山茶區(qū)茶葉產(chǎn)品的多樣性，進(jìn)一步優(yōu)化茶葉的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)。

蘇州洞庭東西山的茶企和茶農(nóng)們已經(jīng)開始嘗試以制作碧螺春紅茶，并獲得較好的市場美譽(yù)度。碧螺紅茶是一款基于洞庭山碧螺春傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)上研制成功的紅茶，屬全發(fā)酵茶，以茶樹新芽葉為原料，經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等典型工藝過程精制而成，其不僅具有碧螺春的條索纖細(xì)、卷曲成螺、香氣濃郁等特點(diǎn)，還使其擁有了紅茶的紅葉、紅湯、紅葉底等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，在原料上更為精細(xì)，而且有一股特別的果香味[2]。但是，目前市售的碧螺春紅茶的加工工藝缺乏相應(yīng)的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)程，產(chǎn)品質(zhì)量等級的評定也沒有國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，市場上紅茶品質(zhì)參差不齊，假冒偽劣，以次充好的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此有必要對碧螺春紅茶的品質(zhì)真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，質(zhì)量等級進(jìn)行評價(jià)，保證原產(chǎn)地茶葉的質(zhì)量和特色，促進(jìn)蘇州洞庭碧螺春紅茶的良性發(fā)展[3]。

香氣是影響茶葉品質(zhì)的重要因素，其不僅影響到茶葉的等級，也是大眾消費(fèi)的重要導(dǎo)向之一。紅茶是我國茶類中的瑰寶，紅茶具有與其他茶類不同的獨(dú)特品質(zhì)，尤其是紅茶的香氣令人心礦神怡，花香、甜香、果香等是紅茶香氣的特征。全世界已經(jīng)從各種茶葉中鑒定出幾百種香氣物質(zhì)，包括醇、醛、酸、酯等[4]。茶葉香氣的檢測目前主要以蒸餾萃取、固相微萃取等分離方法結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行檢測，這些方法要對樣品進(jìn)行前處理，而且耗時(shí)較長，不能滿足快速、原位檢測的要求。

實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜法（direct analysis in real timemass spectrometry，DART-MS）是2005年發(fā)展起來的常溫常壓質(zhì)譜離子化技術(shù)，不僅可以對樣品的化學(xué)成分進(jìn)行原位分析，而且可以在短時(shí)間內(nèi)對大量樣品的分析和鑒別[5-6]。DART作為一種新的常壓離子源，相比于其他電離技術(shù)，DART對樣品分析無需繁雜的化學(xué)處理和冗長的色譜分離，大幅簡化了分析步驟，縮短了分析周期，樣品不需處理或只需簡單的前處理即可分析[7-8]。因此，DART源已被廣泛應(yīng)用食品[9-10]、醫(yī)藥[6-7，11]、司法[12-13]領(lǐng)域的檢測分析中。

因此，本研究運(yùn)用DART-MS檢測對不同產(chǎn)地、不同等級的碧螺春紅茶的香氣物質(zhì)，期望建立一種快速、高效、簡便、準(zhǔn)確鑒定碧螺春紅茶質(zhì)量的方法，以便于區(qū)分產(chǎn)地和鑒定紅茶質(zhì)量，發(fā)揮碧螺春茶葉的地域優(yōu)勢和產(chǎn)品優(yōu)勢，從而更好的保護(hù)碧螺春的茶葉產(chǎn)業(yè)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用碧螺春紅茶購買于蘇州洞庭東山、西山、旺山和無錫新區(qū)。

1.2 儀器

實(shí)時(shí)直接分析離子源（DART-SVP）：IonSense公司；高分辨質(zhì)譜（Q Exactive）：賽默飛科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

茶葉樣品稱取10g，放入清潔的自封袋中。DART離子源出口與VAPUR接口用T型玻璃三通管密封，T型管與采樣袋用特氟龍管連接，將茶葉的香氣成分通過DART真空泵的抽吸采集到離子源出口處，生成離子。

1.4 儀器條件

DART源：反應(yīng)氣為氦氣，氣流量3.0 L/min；加熱器300℃；柵極電壓100 V；正離子模式。

質(zhì)譜條件：掃描范圍50 m/z～350 m/z；毛細(xì)管溫度250 ℃；分辨率 70 000；AGC 1e6；吹掃氣 9 arb；正離子模式。

通過對色譜圖峰的分析，根據(jù)相對分子質(zhì)量、化學(xué)式及分子結(jié)構(gòu)確定峰物質(zhì)名稱。以最高峰為基峰，其他物質(zhì)的峰高與基峰的比值計(jì)算相對豐度。

2 結(jié)果與討論

本試驗(yàn)測定了4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)（東山、西山、旺山和無錫）的碧螺春紅茶，采用DART-MS進(jìn)行香氣物質(zhì)檢測，鑒定出碧螺春紅茶中的28種香氣物質(zhì)（如表1所示），主要有酯類、酮類、醛類、酚類等，還有少量醇類、烴類和含氮類化合物。

碧螺春紅茶的主要酯類物質(zhì)有茉莉酸甲酯、水楊酸甲酯、丙酸橙花酯、丁酸橙花酯、乙酸橙花酯、茉莉內(nèi)酯、甲酸香葉酯等；醇類主要有橙花叔醇、芳樟醇和苯乙醇等；酮類主要有1-羥基-4-氧代-α-紫羅蘭酮、3-氧代-β-紫羅蘭酮、紫羅蘭酮、茉莉酮和茶螺烯酮等；烴類有長葉烯、去氫白菖蒲烯、茶螺烷；酚類物質(zhì)主要有異丁香酚、百里香酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚；醛類主要有橙花醛和反-2，4-庚二烯醛。還檢測出含氮類化合物如吲哚。

表1 經(jīng)DART-MS鑒定的不同產(chǎn)區(qū)碧螺春紅茶中的風(fēng)味物質(zhì)及相對豐度Table 1 Relative abundance of aroma components of Biluochun black tea from different regions detected by DART-MS

2.1 不同產(chǎn)區(qū)的碧螺春紅茶的香氣物質(zhì)種類比較

前人研究表明，紅茶屬于全發(fā)酵茶，其香氣成分主要來自發(fā)酵過程中多酚類物質(zhì)的酶促氧化及偶聯(lián)反應(yīng)，形成以酯類、酮類和醇類為主要特征成分的甜花香，主要有苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯等[14]。其中芳樟醇既有紫丁香、鈴蘭花香，又有果香氣息。香葉醇具有溫和、甜的玫瑰花氣息[15]，苯乙醇具有典型的玫瑰花香。在本研究中鑒定出了3種醇類，橙花叔醇、芳樟醇和苯乙醇，研究表明，醇類是紅茶香氣中最重要的物質(zhì)，祁紅香氣物質(zhì)中67.21%都是醇類物質(zhì)[16]。我國的紅茶香氣大概分為3個(gè)類型，第一類是芳樟醇及其氧化物的含量特別高；第二類是中間型，芳樟醇和香葉醇的含量均比較高；第三類是香葉醇的含量占主導(dǎo)地位[17]，有研究為市售祁紅中的苯甲醇、香葉醇、苯乙醇等成分含量較高，可能是祁紅的特征香氣成分[18]。在本研究中未鑒定出香葉醇，推測碧螺春紅茶的香型屬于第一類。

圖1到圖4分別表示不同產(chǎn)區(qū)碧螺春紅茶DART-MS的離子圖，鑒定結(jié)果如表1所示，東山和西山產(chǎn)區(qū)醇類物質(zhì)的離子相對豐度較高，旺山產(chǎn)區(qū)次之，無錫產(chǎn)區(qū)最低。橙花叔醇在無錫產(chǎn)區(qū)的紅茶中未檢出。苯乙醇在4個(gè)產(chǎn)區(qū)的離子相對豐度普遍高于其他醇類，東山產(chǎn)區(qū)的苯乙醇相對豐度最高。

圖1 東山產(chǎn)區(qū)碧螺春紅茶樣品的DART-MS離子圖Fig.1 DART-MS ion map of Dongshan region“Biluochun”black tea

圖2 西山產(chǎn)區(qū)碧螺春紅茶樣品的DART-MS離子圖Fig.2 DART-MS ion map of Xishan region“Biluochun”black tea

圖3 旺山產(chǎn)區(qū)碧螺春紅茶樣品的DART-MS離子圖Fig.3 DART-MS ion map of Wangshan region“Biluochun”black tea

圖4 無錫產(chǎn)區(qū)碧螺春紅茶樣品的DART-MS離子圖Fig.4 DART-MS ion map of Wuxi region“Biluochun”black tea

酮類化合物也是花香特征的物質(zhì)基礎(chǔ)，形成于發(fā)酵階段，茶葉中大量的類胡蘿卜素氧化，部分降解形成紫羅酮、大馬士酮等[19]。本試驗(yàn)鑒定出的酮類物質(zhì)主要有 1-羥基-4-氧代-α-紫羅蘭酮、3-氧代-β-紫羅蘭酮、紫羅蘭酮、茉莉酮和茶螺烯酮等。紫羅蘭酮、茉莉酮和茉莉酸甲酯呈現(xiàn)茉莉、梔子等甜醇濃厚的花香[20]。茶螺烯酮為β-胡蘿卜素的氧化降解產(chǎn)物，主要呈現(xiàn)果實(shí)、干果類香氣，以上幾種酮類皆是評價(jià)紅茶品質(zhì)的重要香氣物質(zhì)。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，以上4種酮類物質(zhì)的離子相對豐度在東山、西山產(chǎn)區(qū)的紅茶樣品中較高，其次是旺山，無錫產(chǎn)區(qū)最低。

酯類主要有茉莉酸甲酯、水楊酸甲酯、丙酸橙花酯、丁酸橙花酯、乙酸橙花酯、茉莉內(nèi)酯、甲酸香葉酯。其中茉莉內(nèi)酯在4個(gè)不同的紅茶樣品中離子的相對豐度均較高，其次是丙酸橙花酯。丙酸橙花酯有果味蜂蜜香氣，茉莉內(nèi)酯呈現(xiàn)茉莉花香，也有研究表明茉莉內(nèi)酯及其他內(nèi)酯呈現(xiàn)果味香[16]，推測這兩種酯類是碧螺春紅茶的特征香氣成分。這兩種酯類物質(zhì)的相對豐度尤其以東山茶樣中最高，西山、旺山次之，無錫最低。丙酸橙花酯、丁酸橙花酯、乙酸橙花酯主要呈現(xiàn)玫瑰花香和水果的甜香，丙酸橙花酯還有果味蜂蜜香氣，甲酸香葉酯呈現(xiàn)愉快的天竺葵玫瑰香氣。茉莉酸甲酯和水楊酸甲酯是典型的紅茶的香氣成分，水楊酸甲酯呈現(xiàn)出一定的鮮爽而細(xì)銳的冬青葉和類似薄荷精油香味[21]，丁酸橙花酯在無錫和西山產(chǎn)區(qū)的紅茶樣品中未檢出。

本試驗(yàn)鑒定出6個(gè)酚類物質(zhì)，異丁香酚和百里香酚，以及呈現(xiàn)木香味的愈創(chuàng)木酚和衍生物。百里香酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚是碧螺春紅茶的特征峰，尤其以東山產(chǎn)區(qū)相對豐度最高。其他幾個(gè)酚類物質(zhì)如4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚等，也是以東山產(chǎn)區(qū)的相對豐度最高。

本試驗(yàn)鑒定出4個(gè)烴類物質(zhì)，檸檬烯在無錫和東山是離子強(qiáng)度最高的峰，茶螺烷和長葉烯的相對豐度在4個(gè)樣品中也普遍較高，推測這3個(gè)烴類物質(zhì)是碧螺春紅茶主要的烴類物質(zhì)，呈現(xiàn)木香和清淡的香脂香氣。

本試驗(yàn)還鑒定出兩個(gè)醛類物質(zhì)，分別是反-2，4-庚二烯醛和橙花醛，這兩類物質(zhì)是碧螺春紅茶呈現(xiàn)清香味的主要因素。這兩個(gè)物質(zhì)在西山和旺山產(chǎn)區(qū)離子強(qiáng)度最高，在無錫和東山產(chǎn)區(qū)較低。醛類化合物可在發(fā)酵、干燥階段，通過氨基酸的轉(zhuǎn)化或脂質(zhì)氧化降解等方式形成。醛類化合物的呈香特征除了花香以外，也是紅茶清香氣息的重要原因，一般與紅茶的發(fā)酵程度有關(guān)[20]。

2.2 不同產(chǎn)區(qū)的碧螺春紅茶的主要特征香氣物質(zhì)

經(jīng)DART-MS得出，碧螺春紅茶共有的特征性香氣成分有茉莉內(nèi)酯、百里香酚、檸檬烯、橙花醛、紫羅蘭酮等，不同產(chǎn)區(qū)的碧螺春紅茶的特征性香氣成分各有不同。

東山地區(qū)特征香氣物質(zhì)：茉莉內(nèi)酯、橙花醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、百里香酚、檸檬烯、茶螺烷、紫羅蘭酮、異丁香酚、苯乙醇、愈創(chuàng)木酚等。

西山地區(qū)特征香氣物質(zhì)：長葉烯、茶螺烷、茉莉內(nèi)酯、橙花醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、百里香酚、檸檬烯。

旺山地區(qū)特征香氣物質(zhì)：長葉烯、去氫白菖蒲烯、茶螺烷、紫羅蘭酮、茉莉內(nèi)酯、橙花醛、百里香酚、檸檬烯等。

無錫地區(qū)特征香氣物質(zhì)：茉莉內(nèi)酯、橙花醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、百里香酚、檸檬烯。

茶樹遺傳特性、生產(chǎn)環(huán)境和栽培方式等因素會影響茶葉中化學(xué)成分的種類和含量，茶葉的加工過程對茶葉品質(zhì)的轉(zhuǎn)化起到了關(guān)鍵的作用，因此來自不同地區(qū)的品種原料制成的茶樣品質(zhì)各有不同[21]。本試驗(yàn)結(jié)果與茶樹栽培的模式有關(guān)。在洞庭東西山，茶樹的栽培模式主要以茶果間作為主，茶樹種植在枇杷、楊梅、桃樹、板栗等十多種果樹花叢中，花果樹覆蓋率在30%左右，茶樹飽吸四季花果之香[22]，所以發(fā)酵生產(chǎn)的紅茶香氣中檢出此類物質(zhì)的離子豐度也較高。

不同加工工藝對紅茶香氣成分也有較大的影響，茶內(nèi)物質(zhì)的組成與含量因加工方法的不同而有明顯差別。在紅茶制作工藝中，最后一步提香或者干燥工藝會造成低沸點(diǎn)的香氣物質(zhì)揮發(fā)，同時(shí)通過美拉德反應(yīng)等，增加一些吡咯衍生物、吡嗪類衍生物等物質(zhì)，使得干茶具有焦糖香或烘炒香特征[4]。但是本次試驗(yàn)4個(gè)產(chǎn)區(qū)均未鑒定出這類物質(zhì)，除了與茶樹品種有關(guān)，還可能與加工工藝有關(guān)。

2.3 不同級別的碧螺春紅茶的主要特征香氣物質(zhì)

茶香不僅是評價(jià)茶葉等級的標(biāo)準(zhǔn)，也是消費(fèi)者選擇的重要依據(jù)。本試驗(yàn)采用不同級別的碧螺春紅茶（參照國標(biāo)GB/T 13738.2-2008《工夫紅茶標(biāo)準(zhǔn)》），經(jīng)DART-MS測定香氣物質(zhì)，圖5到圖8分別表示西山產(chǎn)區(qū)I級到IV級的DART-MS離子圖，結(jié)果表明，不同級別的碧螺春紅茶的特征性香氣成分各不相同。

由表1可以看出，第I級別西山產(chǎn)區(qū)碧螺春紅茶特征香氣成分中，以烯烴類（檸檬烯、橙花醛、長葉烯、去氫白菖蒲烯）和酚類物質(zhì)（4-乙基愈創(chuàng)木酚、百里香酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚）離子強(qiáng)度較高，其他物質(zhì)種類較少，主要有苯乙醇、反-2，4-庚二烯醛、紫羅蘭酮、茉莉內(nèi)酯。

圖5 西山I級碧螺春紅茶樣品的DART-MS離子圖Fig.5 DART-MS ion map of Xishan region“Biluochun”black tea（Grade I）

圖6 西山II級碧螺春紅茶樣品的DART-MS離子圖Fig.6 DART-MS ion map of Xishan region“Biluochun”black tea（Grade II）

圖7 西山III級碧螺春紅茶樣品的DART-MS離子圖Fig.7 DART-MS ion map of Xishan region“Biluochun”black tea（Grade III）

圖8 西山IV級碧螺春紅茶樣品的DART-MS離子圖Fig.8 DART-MS ion map of Xishan region“Biluochun”black tea（Grade IV）

第II級別和第III級別也顯示同樣的特征，以烯烴類（檸檬烯、長葉烯、去氫白菖蒲烯）和酚類物質(zhì)（百里香酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚）為主，其他種類主要有橙花醛、反-2，4-庚二烯醛、苯乙醇、紫羅蘭酮、茉莉內(nèi)酯等。

第IV級別西山產(chǎn)區(qū)碧螺春紅茶特征香氣成分：茶螺烷、茉莉內(nèi)酯、橙花醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、百里香酚、檸檬烯、反-2，4-庚二烯醛等。

級別較高的碧螺春紅茶，烴類物質(zhì)和酚類物質(zhì)種類較多，級別較低的碧螺春紅茶這兩類物質(zhì)種類相對較少，其他物質(zhì)種類普遍存在于各個(gè)級別的紅茶中。前人研究表明不同級別的滇紅樣品檢測出的香氣物質(zhì)種類不同，高品質(zhì)的滇紅中含有更多的芳樟醇及其氧化物、香葉醇和松油醇等，級別較低的樣品中青葉醛、苯甲醛和苯乙醛的含量較高[23]。

目前，碧螺春紅茶的質(zhì)量等級還沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，大部分是茶農(nóng)靠個(gè)人經(jīng)驗(yàn)生產(chǎn)，實(shí)際生產(chǎn)中對碧螺春紅茶的等級判定還是根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)判定，雖然碧螺春紅茶的加工雖然已經(jīng)制定地方標(biāo)準(zhǔn)（DB3205/T 233-2015蘇州市農(nóng)業(yè)地方標(biāo)準(zhǔn)-蘇州紅茶加工技術(shù)規(guī)程），但是在實(shí)際生產(chǎn)過程中還是農(nóng)戶根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)手工加工，機(jī)械化程度較低，會導(dǎo)致紅茶樣品的品質(zhì)參差不齊，香味滋味各有差異，難以統(tǒng)一，因此，未來亟需對碧螺春紅茶的感官品質(zhì)制定地方標(biāo)準(zhǔn)，更好地發(fā)展蘇州地域特色產(chǎn)品。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)使用DART-MS方法對不同產(chǎn)區(qū)和不同級別的碧螺春紅茶的香氣物質(zhì)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明碧螺春紅茶的主要特征香氣成分主要有酯類、酮類、醛類、酚類等，其中茉莉內(nèi)酯、百里香酚、檸檬烯、橙花醛、紫羅蘭酮等是特征香氣成分，還有少量醇類、烴類和含氮類化合物。

不同產(chǎn)區(qū)的紅茶香氣成分種類不同，其中東山和西山以茉莉內(nèi)酯、橙花醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、百里香酚、檸檬烯、茶螺烷等為主要的特性香氣成分，且離子相對豐度較高，而無錫和旺山離子種類較少，且離子相對豐度較低。

不同級別的碧螺春紅茶的特征性香氣成分各不相同，級別較高的碧螺春紅茶，離子種類較豐富，其中烴類物質(zhì)和酚類物質(zhì)種類較多，而級別較低的碧螺春紅茶，離子種類較少，各類離子相對豐度較低，這也說明了級別越高的碧螺春紅茶，香氣越濃郁。

綜上所述，本研究使用一種快速、便捷且不需要樣品前處理的方法DART-MS對碧螺春紅茶的香氣物質(zhì)進(jìn)行檢測，初步對不同產(chǎn)區(qū)和不同級別進(jìn)行了快速鑒別，為碧螺春紅茶品質(zhì)的提升和指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)提供了參考依據(jù)，未來可以使用DART結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜等更先進(jìn)的方法對碧螺春紅茶的香氣物質(zhì)進(jìn)行更多種類的香氣物質(zhì)進(jìn)行鑒別。