多糖體外抗氧化活性研究進展

劉玉婷，李井雷

（合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽合肥230009）

最近Daniel Granato等在Food Chemistry上發(fā)表了一篇短評，針對幾種主流的體外抗氧化方法在評價食源性抗氧化材料中的作用進行了比較，同時指出雖然大部分體外抗氧化活性檢測方法簡便、價格低廉、具有高通量的特點，但是單純依靠體外抗氧化實驗很難全面評價食品生物材料的抗氧化作用，而且容易產(chǎn)生矛盾的結(jié)果，他們認為在體外抗氧化實驗的基礎上還要結(jié)合使用高效分析手段，例如高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）等分析方法，同時鼓勵使用細胞檢測手段、模擬消化檢測或者是體內(nèi)抗氧化檢測方法綜合評價食源抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力[1]。

多糖是食品中研究的主要對象之一，來源廣泛，具有多種生物活性，其中研究較多的就包括多糖的抗氧化活性。在谷歌學術上以“antioxidant activity”和“polysaccharide”作為關鍵詞搜索可以獲得14萬1千條搜索結(jié)果，如果按照年份進行統(tǒng)計的話，從2014年開始每年的論文發(fā)表量都穩(wěn)步增加，2017年達到20200篇，截止到2018年6月份有13400篇相關論文發(fā)表（圖1）。其中，中國學者發(fā)表的論文占了所有論文的大部分，近五年來穩(wěn)定在70%～80%之間。同時，利用百度學術對中文文獻（包括期刊論文、學位論文和會議論文）以“抗氧化”和“多糖”作為關鍵詞進行搜索可以獲得45 200篇論文，近五年的論文數(shù)量穩(wěn)定在11 000篇左右（圖2）。從論文數(shù)量以及中國學者發(fā)表論文占比上來看，無論是國內(nèi)還是國外對于多糖的抗氧化活性都非常的關注，使得多糖的抗氧化已然成為食品、生物領域研究的熱點話題。通過對文獻的總結(jié)，針對多糖抗氧化活性主要是通過3種方式進行表征：體外實驗、細胞實驗以及活體實驗。其中，由于操作簡便，儀器設備要求不高，以及費用低廉等因素，體外實驗在多糖抗氧化活性研究中占據(jù)了最大的比重，也被大部分研究人員廣泛使用。

圖1 谷歌學術中多糖抗氧化論文數(shù)量和中國學者論文占比情況統(tǒng)計（截止2018年6月）Fig.1 Statistics on the number of antioxidant polysaccharide papers in Google scholar and the proportion of Chinese scholars’papers（as of June 2018）

圖2 百度學術關于多糖抗氧化中文論文統(tǒng)計（截止2018年6月）Fig.2 Baidu scholar statistics of Chinese papers on antioxidant polysaccharide（as of June 2018）

但是由于多糖分子量大、結(jié)構(gòu)復雜、分離純化難度大，使得采用體外實驗來檢測其抗氧化活性存在一定的困難，并且通用的多種體外抗氧化試驗由于其試驗方法的不同，可能適用于不同的對象和試驗體系。以上種種原因使得多糖體外抗氧化活性結(jié)果之間缺乏對比，而且有時候產(chǎn)生矛盾的結(jié)果。因此，我們對近5年來關于多糖體外抗氧化活性的試驗結(jié)果進行一個綜述，主要目的在于通過文獻的分析來比較不同體外抗氧化實驗方法以及影響多糖抗氧化效果的主要因素，為后續(xù)的相關研究提供一定的基礎和依據(jù)。

1 體外抗氧化主要方法

根據(jù)楊洋等的定義，抗氧化劑主要作為一種食品添加劑，主要作用是阻止或者延緩食品在加工、貯藏過程中因氧化而發(fā)生的營養(yǎng)損失、褪色、褐變等質(zhì)量變化[2]。而根據(jù)B Halliwell等的定義，抗氧化劑是在低于易氧化底物濃度存在的情況下，可以有效抑制底物的氧化的物質(zhì)[3]?？寡趸瘎┌凑杖芙庑钥梢苑譃樗苄钥寡趸瘎┖陀腿苄钥寡趸瘎?，多糖屬于水溶性物質(zhì)，因此可以歸為水溶性抗氧化劑。

抗氧化劑的抗氧化機理主要可以歸納為：消除活性自由基、消除非活性氧化因子、結(jié)合金屬離子等，而影響多糖抗氧化活性的因素較多，可能包括多糖的來源、化學結(jié)構(gòu)、分子量、純度、空間構(gòu)象等。針對多糖的體外抗氧化試驗方法，基本上可以總結(jié)為1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）活性自由基清除能力；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazo line-6-sulphonate），ABTS+·]活性自由基清除能力；·OH活性自由基清除能力；NO2-活性自由基清除能力；鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）；氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）；超氧陰離子自由基清除能力；NO·自由基清除能力；金屬離子螯合能力；過氧化氫自由基抑制試驗；總抗氧化能力；還原力；脂質(zhì)過氧化抑制能力等。對于每一種方法具體的試驗步驟和試驗原理可以參照相關文獻[4-5]，本文主要討論以上各種方法在評價多糖抗氧化性上的適用性以及影響多糖抗氧化活性的主要因素。

2 主要體外抗氧化試驗

2.1 DPPH·清除能力

DPPH·清除試驗方法簡單，經(jīng)常被學者用于評價多糖抗氧化能力，文獻報道中的具體試驗方法會根據(jù)實際情況有所調(diào)整。DPPH法的工作溶液主要使用甲醇或者乙醇溶液配制，其最終反應體系中的水含量一般在0%～40%之間，大部分DPPH清除試驗中水分含量低于20%[6-8]。而多糖屬于高分子物質(zhì)，易溶于水，而不溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，即使在含有部分水的DPPH工作溶液中，多糖也很容易析出，造成溶液渾濁。而大部分DPPH·清除試驗的反應時間為10 min～30 min，在這個時間段，析出的多糖大部分還以懸濁狀態(tài)存在于反應溶液中，在使用分光光度計來檢測反應溶液的吸光值的時候極易對最終的結(jié)果造成影響，甚至產(chǎn)出錯誤的結(jié)果。因此，雖然部分活性多糖可以降低反應溶液的吸光值，表現(xiàn)出一定的抗氧化性，但可以通過對相關試驗方法進行一定的修正來減少誤差。由于多糖的分子量大小差異較大，但總體上反應體系中的多糖濃度較低，因此可以在反應結(jié)束后使用離心或者過濾的方式去除掉沉淀的多糖，而檢測上清液或者濾液在517 nm的吸光值來計算其抗氧化活性。

曲偉等對龍井茶葉多糖進行了分離純化，并檢測了精制多糖、水洗脫部分多糖和甲醇洗脫部分多糖的DPPH·清除能力，結(jié)果說明龍井茶葉多糖及其結(jié)合物均具有較強的清除自由基的能力[9]。洪燕萍等對枇杷葉多糖進行純化，并比較純化前后的多糖的DPPH·清除能力，其結(jié)果顯示利用大孔樹脂純化后多糖的純度提高，而粗多糖中含有的蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)減少，同時抗氧化能力顯著提高，說明多糖的純度對于其抗氧化能力有顯著的影響[10]。

2.2 ABTS+·清除能力

同DPPH·類似，ABTS+·可以和體系中存在的抗氧化物質(zhì)結(jié)合而使反應體系褪色，通過檢測反應體系在734 nm下的吸光值間接反應其抗氧化能力。試驗過程和方法原理可以參照相關文獻[11]。ABTS+·清除能力試驗同樣大部分在乙醇溶液中進行，反應溶液中乙醇的含量在70%左右[12]。因此，使用ABTS+·法檢測多糖抗氧化活性依然面臨多糖析出，影響吸光值結(jié)果的問題，在實際操作過程中需要對試驗方法進行一定的改進。

2.3 ·OH清除能力

·OH是主要是通過Fenton反應來產(chǎn)生，然后利用·OH氧化鄰二氮菲-Fe2+為鄰二氮菲-Fe3+使溶液在530 nm處的吸光值降低，而多糖等抗氧化劑可以抑制·OH的氧化作用，通過檢測溶液的吸光值可以間接反應其抗氧化活性[13-14]。該試驗方法主要在水溶液體系中進行，不存在多糖析出的問題，而且通過對數(shù)據(jù)庫中的相關文獻數(shù)量進行對比也可以發(fā)現(xiàn)在評價多糖抗氧化方面，相比于DPPH·和ABTS+·清除能力，該方法使用更加頻繁（表1）。

2.4 NO2-活性自由基清除能力

亞硝酸根離子在體內(nèi)可以生成N-亞硝基化合物，后者具有較強的致癌性，因此部分文獻將清除亞硝酸根離子的能力歸為抗癌指標[15]，而更多文獻中也把亞硝酸根離子清除活性歸為抗氧化活性的范圍[4，16-17]。

劉海英等對比平菇、杏鮑菇和白靈菇菌絲多糖對·OH、DPPH·和NO2-的體外清除作用，發(fā)現(xiàn)相同濃度下，多糖溶液對NO2-自由基清除能力最差，對DPPH·清除能力最大[18]。于淑池等比較了龍井茶多糖對自由基和NO2-自由基清除作用，發(fā)現(xiàn)龍井茶多糖可有效清除超氧陰離子自由基、羥基自由基、NO2-，并且對NO2-清除能力最強[19]。梁少茹等制備了乙?；揎椀木G茶多糖，并發(fā)現(xiàn)通過乙?；揎椇蠖嗵堑膶2-·、·OH和NO2-體外清除活性顯著提高，說明化學結(jié)構(gòu)的改變會顯著影響多糖的抗氧化活性[20]。

2.5 氧自由基清除能力（oxygen radical absorption capacity，ORAC）

ORAC法是一種常用的體外抗氧化能力檢測方法，經(jīng)常用于多糖的抗氧化活性體外檢測，該方法具體的實驗原理和方法可以參照相關文獻[21]。Luca Casettari等比較多種不同修飾的殼聚糖的ORAC值，結(jié)果表明N-乙酰半胱氨酸修飾的殼聚糖抗氧化能力最強，沒食子酸和水楊酸修飾的殼聚糖抗氧化能力緊隨其后，同時指出ORAC值和總酚含量具有較強的相關性，說明多糖抗氧化活性可能與其分子鏈結(jié)合物質(zhì)有關[22]。Baojun Xu等采用ORAC法和FRAP法檢測不同來源和分子量的β-葡聚糖的抗氧化性，結(jié)果說明不同來源的β-葡聚糖的抗氧化性能明顯不同，而且分子量也顯著影響其抗氧化值，但分子量的影響沒有顯著的規(guī)律，這可能和多糖分子呈現(xiàn)的空間構(gòu)象有一定的關系[23]。需要注意的是在2012年美國農(nóng)業(yè)部將該方法從其網(wǎng)站上移除，理由為大量的證據(jù)表明ORAC值和任何活性物質(zhì)以及人體健康沒有關系[24]。

2.6 鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）

FRAP法主要通過檢測Fe3+被體系中的還原物質(zhì)還原為Fe2+的能力，因此FRAP法是一種還原力檢測方法。如前所述，多糖的分子量可以影響其抗氧化能力，仇農(nóng)學等利用超濾法將枸杞多糖進行了分離并檢測其FRAP值，結(jié)果顯示多糖的分子量對于其還原力具有一定的影響，但是不呈現(xiàn)明顯的規(guī)律，還原力最強的組分為30 kDa～1 000 kDa的多糖組分，說明除了分子量還有其他的影響因素[25]。Hua-Bin Li等從49種可食用蘑菇中獲得粗多糖并評估了其還原力以及抗氧化能力，結(jié)果顯示粗多糖的抗氧化能力和其中含有的多酚含量有直接的關系，并指出多酚很有可能是這些可食用蘑菇抗氧化能力的來源[26]。Sheng-quan Huang的研究結(jié)果也顯示，經(jīng)過初步分離純化的多糖還原力和抗氧化能力和多糖中糖醛酸以及蛋白質(zhì)成分含量直接相關，印證了Hua-Bin Li等的研究結(jié)果[27]。

2.7 超氧陰離子自由基清除能力

超氧自由基一般利用鄰苯三酚在弱堿環(huán)境下的自氧化來產(chǎn)生，通過檢測特定波長下的吸光值來間接反應多糖物質(zhì)的抗氧化能力[27]。有學者使用氯化硝基四氮唑藍顯色來檢測抗氧化活性，但是使用該方法檢測多糖抗氧化的研究較少[8，29-30]。唐軍榮等檢測了鐵皮石斛多糖的體外抗氧化活性，結(jié)果顯示鐵皮石斛多糖對超氧陰離子自由基清除能力比VC還要高，說明鐵皮石斛多糖具有較強的抗氧化能力[31]。Ellen C.Giese利用還原檸嗪酸產(chǎn)生超氧陰離子自由基，并用氯化硝基四氮唑藍顯色來測試超氧陰離子自由基含量，檢測多種β-葡聚糖抗氧化性[14]。

2.8 螯合金屬離子能力

通過螯合溶液中的金屬離子，抑制金屬離子的催化氧化自由基鏈式反應，達到抑制氧化作用的目的，因此可以檢測多糖等抗氧化物質(zhì)對于金屬離子的螯合活性而檢測其抗氧化活性。常用的檢測方法是利用Fe2+，在菲啰嗪存在的情況下測試其在562 nm下的吸光值來確定多糖對金屬離子的螯合作用[32]。多糖的其他抗氧化指標和螯合金屬離子能力成正相關，但是具體的聯(lián)系和金屬離子敖合機理探討的較少[33-34]。

3 多糖純度與抗氧化能力

從天然物質(zhì)中提取多糖需要經(jīng)過提取-醇沉-脫蛋白-脫色-透析等步驟獲得初步純化的多糖，這時候獲得的多糖可能還含有部分的蛋白質(zhì)、多酚等雜質(zhì)，同時獲得的多糖很有可能是多種單一多糖的混合物，進一步分離純化需要通過多種凝膠柱，根據(jù)多糖對不同凝膠材料的吸附能力不同進行分離純化。

在多糖的分離純化過程中，伴隨著多糖純度的提高，其中含有的雜質(zhì)量減少，多糖的抗氧化活性也發(fā)生變化。從報道的研究結(jié)果中可知，和未經(jīng)純化的粗多糖相比，純化后的多糖抗氧化活性可能提高，也可能降低，這可能與多糖的來源以及多糖的分子量、空間構(gòu)象、單糖成分和鏈接方式等諸多因素有關。

趙玉紅等使用采用DEAE-52離子交換層析和Sepharose CL-6B凝膠排阻層析分離純化了鹿茸多糖，得到一種單一多糖，研究其抗氧化活性發(fā)現(xiàn)純化后的多糖抗氧化活性比純化前的粗多糖顯著提高[35]。廉宜君等對甘草渣多糖、侯秀娟等對化橘紅多糖、顏軍等對銀耳多糖的研究也顯示純化后的多糖比粗多糖顯示出更高的體外抗氧化活性[36-38]。

然而，并不是所有的粗多糖的抗氧化活性都低于純多糖，趙天湖等大葉冬青苦丁茶多糖進行研究，發(fā)現(xiàn)在相同濃度情況下，大葉冬青苦丁茶粗多糖抗氧化活性最強，顯著高于其他純多糖組分[39]。石學連等對滸苔多糖、何玲玲等對板栗多糖、聶凌鴻等對廣東淮山水溶性多糖、李珊珊等對人參果多糖的研究也得到了類似的結(jié)果[40-43]。而刁文超等對南瓜多糖的研究表明南瓜粗多糖的抗氧化性和3種純多糖相比處于中間水平，低于組分P11，但是高于組分P21，說明除了多糖的純度，其他的因素也影響多糖的抗氧化能力[44]。

通過使用不同的溶劑提取獲得不同的多糖組分也具有不同的抗氧化活性，陳蓉蓉等研究牛大力多糖的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)牛大力水提物的抗氧化能力最佳，其次是牛大力醇沉物，而牛大力粗多糖的抗氧化活性最差[45]。歐陽臻等使用50%和80%的乙醇沉淀金蟬花多糖并檢測了其抗氧化活性，結(jié)果顯示50%乙醇沉淀獲得的多糖組分的抗氧化活性顯著高于80%乙醇沉淀獲得的多糖[46]。

4 多糖分子量與抗氧化活性

多糖分子量一般較大，而通過分離純化后可以獲得多個多糖組分，這些多糖組分的分子量有所不同。研究顯示，相同來源的多糖分子量可能對于多糖的抗氧化活性產(chǎn)生影響。

潘瑩等分離純化冬棗多糖，得到分子量不同的2個組分，研究發(fā)現(xiàn)這2個多糖組分對羥自由基和DPPH·清除能力不同，分子量較大（3.02×105Da）的組分對自由基的清除能力顯著高于分子量較?。?.04×104Da）的組分[47]。徐雪峰等對赤靈芝多糖的研究也得到了類似的結(jié)果，從赤靈芝粗多糖中分離獲得了3種純化多糖，并且發(fā)現(xiàn)分子量最大的多糖組分的抗氧化活性最佳[48]。而邵平等對海藻多糖的研究顯示，中等分子量的海藻多糖抗氧化能力顯著高于其他分子量的多糖組分[49]。羅建平等針對不同分子量的石斛多糖的體外抗氧化活性進行了研究，結(jié)果顯示分子量較?。ㄐ∮?.53×104Da）和分子量較大（大于 7.44×104Da）的多糖組分的抗氧化活性較強，說明石斛多糖的體外抗氧化能力與分子量具有直接的關系[50]。除此之外，其他的因素包括提取方法、提取時間、提取溫度也會對多糖的抗氧化能力產(chǎn)生影響[51-53]。

5 結(jié)論

由于體外抗氧化試驗具有實驗方法簡單、試驗周期短、高通量獲得數(shù)據(jù)等諸多優(yōu)點，近些年成為了研究多糖生物活性的重要的檢測指標。然而，研究人員在進行多糖抗氧化能力檢測的時候需要針對多糖的性質(zhì)選擇合適的檢測方法，全面而真實的反應多糖的抗氧化能力。在多糖體外抗氧化活性檢測過程中，對于明顯影響其最終結(jié)果的試驗方法要根據(jù)實際情況進行改進，否則很容易獲得錯誤的試驗數(shù)據(jù)。

同時，對于多糖抗氧化活性的物質(zhì)來源也需要進一步的探索。隨著多糖的純化過程，粗多糖中含量較多的蛋白質(zhì)、酚類等物質(zhì)將減少，而純多糖組分含量上升，這勢必會對多糖的抗氧化能力產(chǎn)生影響。目前，研究人員對于分離純化如何影響抗氧化能力還沒有確定的結(jié)論，因此有必要進一步闡釋純化對于多糖抗氧化能力的影響以及可能的作用機理。除此之外，多糖的分子量也顯著影響多糖的抗氧化能力，但是這方面的研究依然比較欠缺。其他重要因素，包括多糖的單糖組成、糖苷鍵鏈接方式、多糖的空間構(gòu)象等理化性質(zhì)如何影響多糖的抗氧化能力也需要進一步的研究[54]。

大部分食品源活性多糖進入人體的過程都要經(jīng)過消化道的消化過程，在這個過程中由于各種消化酶、消化液以及微生物的作用可能發(fā)生分子鏈的斷裂、分子量的降低以及空間結(jié)構(gòu)的改變，伴隨這多糖理化性質(zhì)的變化其抗氧化、抗炎癥等活性也會發(fā)生顯著的變化，并最終影響活性多糖的生物可利用度以及生物活性，因此多糖在消化過程中的活性變化已經(jīng)引起了研究人員的關注，并逐漸報道這方面的研究結(jié)果[55-56]。

正如Daniel Granato等[1]指出的一樣，針對多糖的抗氧化活性，單純依靠體外試驗顯然是不足的，需要加強細胞抗氧化活性的方法研究和實踐整理，同時對于多糖經(jīng)過消化道如何被消化液消化處理，以及在大腸中如何被腸道微生物作用，以及是否發(fā)生分子鏈的斷裂，產(chǎn)生何種主要組分，其抗氧化等活性如何，是多糖研究中需要特別注意的問題。