響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取壺瓶棗多酚工藝研究

李海平，高艷芳，姚宇，彭丹，曹竹林，王迎進(jìn)

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

壺瓶棗（Zizyphusjujuba cv.Huping）為鼠李科棗屬植物果實，以形似“壺狀”而得名，主要產(chǎn)于山西太古、榆次等地。壺瓶棗中含有多種維生素、多糖、多酚、氨基酸和微量元素，具有較高營養(yǎng)價值[1]。中醫(yī)也認(rèn)為壺瓶棗具有益氣安神、養(yǎng)血潤肺和治虛解毒等功效?？茖W(xué)研究表明，壺瓶棗多酚是壺瓶棗中的主要活性成分之一，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛等多種生物活性[2-10]。因而，開展壺瓶棗多酚提取研究，對于壺瓶棗資源的深度開發(fā)利用具有重要的實際意義。超聲波輔助提取技術(shù)是利用“空化效應(yīng)”破壞植物細(xì)胞壁，加速有效成分從原料中溶出和擴散的一種高效提取技術(shù)，在植物有效活性成分提取中具有廣泛應(yīng)用[11-12]。本試驗采用超聲輔助法提取壺瓶棗中多酚，并且利用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計響應(yīng)面法優(yōu)化壺瓶棗多酚的提取工藝條件，為壺瓶棗資源的合理利用和深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壺瓶棗：山西省忻州市華美超市，產(chǎn)自山西太谷，將壺瓶棗去核，60℃烘干，植物粉碎機粉碎，過60目篩；沒食子酸：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；無水碳酸鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）、福林酚（Folin-Phenol）試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-S8型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；723型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；SHZ-III型循環(huán)水式真空泵：上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以沒食子酸為對照品，采用FC法測定多酚含量[13-14]。準(zhǔn)確稱量10 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，溶解并定容至100 mL容量瓶，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL沒食子酸 標(biāo)準(zhǔn)溶液；精確吸取 0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL比色管中并定容；準(zhǔn)確吸取上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液0.40 mL于10 mL離心管中，加入1.00 mL的福林酚試劑，放置5 min，加入2.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的Na2CO3溶液，混勻，蒸餾水定容到8 mL。50℃下恒溫水浴5min，冷卻至室溫進(jìn)行測量。以試劑空白為對照試驗，用分光光度計測定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在740 nm處吸光度值。繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度與其質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程為y=139.03x-0.005 6（R2=0.997 5）。

1.3.2 壺瓶棗多酚的提取方法

準(zhǔn)確稱取干燥壺瓶棗粉末0.5 g，加溶劑超聲輔助提取，抽濾，濾渣重提1次，合并濾液。定容至50 mL容量瓶中，搖勻。移取1.00 mL提取液定容至10 mL比色管中。按照1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作法測定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)方程計算壺瓶棗多酚提取率。

1.3.3 壺瓶棗多酚提取率計算

式中：C為從線性回歸方程中求出壺瓶棗多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為粗提液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為原料質(zhì)量，g。

1.3.4 壺瓶棗多酚提取工藝條件單因素試驗

1.3.4.1 單因素試驗設(shè)計[15]

按照上述壺瓶棗多酚提取方法，以壺瓶棗多酚提取率為響應(yīng)值，準(zhǔn)確稱取0.5 g壺瓶棗粉末，以液料比15∶1（mL/g）、超聲功率 160 W、提取溫度 40℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、超聲時間20 min作為單因素試驗的基礎(chǔ)，改變液料比 [15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1（mL/g）]、超聲功率（160、200、240、280 W 和 320 W）、提取溫度（40、50、60、70℃和80℃）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（10%、20%、30%、40%和 50%）和超聲時間（10、20、30、40 min和50 min）中某一因素，重復(fù)3次試驗，考察各單因素對壺瓶棗多酚提取率影響。

1.3.4.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0.6，選取提取溫度（A）、超聲功率（B）、液料比（C）3個因素，以壺瓶棗多酚提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗，得到二次回歸方程，并確定最佳工藝條件。試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

不同單因素對壺瓶棗多酚提取率的影響見圖1。

2.1.1 超聲功率對壺瓶棗多酚提取率影響

圖1 不同單因素對壺瓶棗多酚提取率的影響Fig.1 Effect of different extraction parameters on the yield of polyphenols from Huping jujube

由圖1（a）可知，在160 W～200 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率增大，壺瓶棗多酚提取率逐漸升高。這是由于超聲波提取是利用超聲波的機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子運動速度，以增大其穿透力，從而加速多酚溶出，提高了壺瓶棗多酚提取率[3]。當(dāng)超聲功率達(dá)到200 W時，多酚提取率達(dá)到最高。因此，確定200 W為較佳提取超聲功率。

2.1.2 提取溫度對壺瓶棗多酚提取率影響

由圖1（b）可知，在40℃～70℃，隨著提取溫度升高，壺瓶棗多酚提取率逐漸升高。這是由于高溫能夠提高溶劑的滲透能力和壺瓶棗多酚的溶解度，從而提高提取物的擴散速度，使壺瓶棗多酚更容易從細(xì)胞壁內(nèi)擴散出來。當(dāng)溫度達(dá)到70℃時，多酚提取率達(dá)到最高。超過70℃后，提取率下降，這是由于溫度過高導(dǎo)致了溶劑揮發(fā)，提取率降低。同時溫度過高也會導(dǎo)致壺瓶棗多酚的過度氧化，生物活性降低[16]。因此，確定70℃為較佳提取溫度。

2.1.3 液料比對壺瓶棗多酚提取率的影響

由圖 1（c）可知，在 15 ∶1～25 ∶1（mL/g），隨著液料比增大，壺瓶棗多酚提取率逐漸升高，當(dāng)液料比達(dá)到25∶1 mL/g時，提取率達(dá)到最高。超過 25∶1（mL/g）后，壺瓶棗多酚提取率反而下降，這是由于溶劑用量增大，超聲波與壺瓶棗粉作用減弱，多酚提取率降低[5]。因此，確定25∶1（mL/g）為較佳提取液料比。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對壺瓶棗多酚提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對壺瓶棗多酚提取率的影響見圖1（d）。由圖 1（d）可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時，壺瓶棗多酚提取率最高。說明體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇溶劑極性與壺瓶棗多酚極性比較接近，能夠促進(jìn)多酚溶出，提高其提取率。因此，確定10%乙醇為較佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.1.5 超聲時間對壺瓶棗多酚提取率的影響

超聲時間對壺瓶棗多酚提取率的影響結(jié)果見圖1（e）。由圖 1（e）可知，在 10 min～30 min，隨著超聲時間增加，壺瓶棗多酚提取率緩慢升高。這是由于時間延長，原料能夠充分提取。當(dāng)超聲時間達(dá)到30 min時，壺瓶棗多酚提取率達(dá)到最高。超過30 min后，大部分的多酚化合物都已溶出，再延長超聲時間，壺瓶棗多酚提取率趨于恒定。由于延長超聲時間有可能對壺瓶棗多酚結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[17]，因此選用30 min為最佳超聲時間。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化壺瓶棗多酚提取工藝

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理和單因素試驗結(jié)果（乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間兩試驗因素對壺瓶棗多酚提取率影響較?。?，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法優(yōu)化壺瓶棗多酚提取工藝參數(shù)，響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果Table 2 Program and results of response surface analysis

2.2.1 二次響應(yīng)面回歸模型建立

對上述得到的17個中心試驗點響應(yīng)值，進(jìn)行回歸擬合分析，可得到提取條件與多酚提取率二者之間二次多項式擬合模型：

2.2.2 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

對回歸模型進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表3可知，該模型顯著性極高（p＜0.01）；失擬項p=0.059 9＞0.05，說明失擬程度不顯著，即試驗數(shù)據(jù)與模型相符較好[14]。模型確定系數(shù)R2=0.945 9，說明回歸方程能夠很好地模擬真實曲面。模型調(diào)整確定系數(shù)Radj2=0.876 3，說明有87.63%響應(yīng)值變化可以用此模型來解釋。模型確定系數(shù)和調(diào)整確定系數(shù)比較相近，說明模型的預(yù)測性良好，試驗誤差小。變異系數(shù)CV為4.95%，說明試驗數(shù)據(jù)離散程度可以接受。信噪比（adeq precision=9.860）較大，說明多酚的提取率可用該模型進(jìn)行估計和分析。另外，回歸方程各項方差表明，A2、B2、C2對壺瓶棗多酚提取率影響極顯著（p＜0.01），A、B、BC對壺瓶棗多酚提取率影響顯著（p＜0.05），C、AB、AC對壺瓶棗多酚提取率影響不顯著（p＞0.05）[17-18]。

2.2.3 響應(yīng)面圖分析

圖2為任意兩因素對壺瓶棗多酚提取率影響的響應(yīng)面圖，從響應(yīng)面圖上可以直接分析出兩因素對多酚提取率的影響。

由圖2可知，提取溫度和超聲功率對多酚提取率影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，液料比因素對提取率影響較小，表現(xiàn)為曲線較為平滑，響應(yīng)值變化較小[19-20]。各單因素對壺瓶棗多酚提取率影響大小順序為：提取溫度（A）＞超聲功率（B）＞液料比（C）。液料比和超聲功率之間的交互作用對壺瓶棗多酚提取率影響顯著。

圖2 不同因素交互作用對壺瓶棗多酚提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots of the interaction of different extraction parameters on the yield of polyphenols from Huping jujube

圖3為任意兩因素對壺瓶棗多酚提取率影響的等值線圖。

從圖3（a）等值線圖上可以看出，超聲功率和提取溫度的交互因素最弱，表現(xiàn)為等值線為圓形。液料比和超聲功率的交互作用最強，表現(xiàn)為等值線圖為橢圓形[圖3（c）]。這與回歸方程的方差分析結(jié)果一致，說明該模型能夠很好地反應(yīng)超聲功率、提取溫度和液料比3個因素對壺瓶棗多酚提取率的影響。

圖3 不同因素交互作用對壺瓶棗多酚提取率影響的等值線圖Fig.3 The contour plots of the interaction of different extraction parameters on the yield of polyphenols from Huping jujube

對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，求得壺瓶棗多酚最佳提取工藝條件為提取溫度68.1℃，超聲功率208 W、液料比 25.9∶1（mL/g），此條件下壺瓶棗多酚理論提取率為4.33%。為了檢驗試驗結(jié)果可靠性，對上述試驗結(jié)果進(jìn)行近似驗證試驗，考慮到實際操作局限性，將壺瓶棗多酚工藝條件確定為提取溫度68℃、超聲功率200 W和液料比26∶1（mL/g）。在此條件下進(jìn)行3次平行測定試驗進(jìn)行驗證，得到壺瓶棗多酚平均提取率為4.35%，表明試驗值與回歸模型預(yù)測的理論值吻合良好，也進(jìn)一步驗證了該理論模型的可行性。

3 結(jié)論

本試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法建立了以壺瓶棗多酚提取率為響應(yīng)值，以提取溫度、超聲功率和液料比為因變量的壺瓶棗多酚超聲輔助提取工藝二次多項式理論模型，模型擬合度良好。方差分析表明三因素對壺瓶棗多酚超聲提取影響大小為：提取溫度＞超聲功率＞液料比。最終確定最佳提取工藝條件為：提取溫度68℃、超聲功率200W和液料比26∶1（mL/g）。此條件下，壺瓶棗多酚提取率為4.35%，為壺瓶棗資源的深度開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。