不同方法提取地榆總?cè)坪康谋容^及其抗氧化活性研究

王森業(yè)，殷博迪，王玉寧，陳勝昔，錢慧琴，*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000；2.河南師范大學(xué)，河南新鄉(xiāng)453000）

地榆為薔薇科地榆屬植物地榆（Sanguisorba officinalis）或長葉地榆 （Sanguisorba officinalis var.longifolia）的干燥根，具有涼血止血、解毒斂瘡的作用[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，地榆具有止血[2]、抗腫瘤[3]、抗過敏[4]、抗炎[5]、改變血液系統(tǒng)[6]、抗氧化[7-8]等作用。地榆主要含有鞣質(zhì)類、三萜皂苷類、黃酮類和酚酸類等化學(xué)成分[9]。目前，國內(nèi)對地榆多酚和總黃酮抗氧化能力已有文獻報道[7-8]，而地榆總?cè)频目寡趸钚晕匆妶蟮?，而天然產(chǎn)物抗氧化能力與活性成分含量有關(guān)，因此，研究不同提取方法對地榆總?cè)频暮康挠绊懠捌涮崛∥锏目寡趸钚允呛苡斜匾Ｄ壳?，提取總?cè)频姆椒ㄝ^多，張爽、林水花等[11-12]利用超聲提取法取得一定成果。本研究采用水煮醇沉法、浸漬法和回流提取法[10]比較地榆總?cè)频奶崛」に?，以熊果酸為對照，紫外分光光度法測定地榆總?cè)坪?，確定其最佳提取方法，并對地榆總?cè)铺崛∥锟寡趸钚阅芰M行評價，為地榆三萜類化合物的提取和抗氧化活性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地榆：于2017年8月采自河南省新鄉(xiāng)市萬仙山國家森林公園，經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院教授閆福林鑒定為薔薇科地榆屬植物地榆。熊果酸（批號110742-201622）：中國食品藥品檢定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（CAS：1898-66-4）：東京化成工業(yè)株式會社；VC（J07N7R24305）：源葉生物科技有限公司；高氯酸、香草醛、冰乙酸、甲醇、無水乙醇：均為分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；HH恒溫水浴鍋：金壇市中大儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；SHZ-3型循環(huán)水式真空泵：鄭州杜甫儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

新鮮地榆的根洗凈，用濾紙吸干，于60℃烘干，粉碎，過篩（60目），將烘干樣品放入廣口瓶，置于-20℃冰箱保存，備用。

1.3.2 提取方法

1.3.2.1 水煮醇沉法

精密稱取地榆根粉末 5.0 g，分別按 1 ∶10、1 ∶8、1 ∶6（g/mL）的料液比加水溶液，煎煮3次，分別煮沸2、1、1 h，合并 3次濾液，濃縮至 1∶1（1 g生藥相當(dāng)1 mL），然后加入2倍體積95%乙醇沉淀，放置24 h，過濾，濾液濃縮干燥得總提取物，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.2.2 回流提取法

精密稱取地榆根粉末5.0 g，按1∶10（g/mL）的料液比加60%乙醇溶液加熱回流提取，提取3次，每次2 h，合并3次濾液，濃縮干燥得總提取物，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.2.3 浸漬法

精密稱取地榆根粉末5.0 g，按1∶10（g/mL）的料液比加60%乙醇溶液室溫下浸提5 d，浸提3次，濾過，濾液濃縮干燥稱量得總提取物，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.3 不同提取方法中地榆總?cè)坪繙y定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至恒重的熊果酸對照品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解，定容，搖勻即得濃度為0.10 mg/mL的熊果酸對照品溶液。精密吸取熊果酸對照品溶液 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL置于試管中，水浴蒸干無水乙醇，加0.2 mL香草醛-冰乙酸溶液和1.0 mL高氯酸，在60℃水浴加熱15 min后，移入冰水浴中，再加入5.0mL冰乙酸，搖勻，在545 nm處測定吸光度值。以熊果酸濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)進行線性回歸。

1.3.3.2 精密度試驗

精密移取6份熊果酸對照品溶液0.2 mL于試管中，按“1.3.3.1”項下方法測定吸光度值（A），計算平均值及RSD值。

1.3.3.3 穩(wěn)定性試驗

取“1.3.2.2”項下樣品溶液0.2 mL，定容于10 mL容量瓶中，得樣品稀釋液，再精密移取6份0.2 mL上述溶液，分別于 0、25、50、75、100、125 min 按“1.3.3.1”項下方法測定吸光度值（A），計算平均值及RSD值。

1.3.3.4 重復(fù)性試驗

取“1.3.2.2”項下樣品溶液0.2 mL，定容于10 mL容量瓶中，得樣品稀釋液，再精密移取6份0.2 mL上述溶液，按“1.3.3.1”項下方法測定吸光度值（A），計算平均值及RSD值。

1.3.3.5 加樣回收率試驗

分別取乙醇回流法供試品溶液6份0.2 mL，定容于10 mL容量瓶中，得樣品稀釋液，再分別精密移取6份1.0 mL上述溶液，加入對照品0.1 mL，按“1.3.3.1”項下方法測定吸光度值（A），計算平均值及RSD值。

1.3.3.6 地榆總?cè)坪繙y定

分別精密吸取水煮醇沉法、乙醇回流法、浸漬法供試品溶液0.2 mL，定容于10 mL容量瓶中，得樣品稀釋液，再精密吸取樣品稀釋液0.2 mL按“1.3.3.1”項下方法測定吸光度值（A），按回歸方程式計算出不同提取方法所得提取物的總?cè)坪俊?/p>

1.3.4 地榆總?cè)瓶寡趸钚詼y定

1.3.4.1 DPPH溶液的配制

參照曾智等[13-14]的方法加以修改后，精密稱取13.0 mg的DPPH粉末到250 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，定容，搖勻，制得濃度為0.13 mmol/L的DPPH溶液，備用。

1.3.4.2 VC樣品溶液的配制

精確稱定VC10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，無水乙醇定容，配制成VC濃度為0.56 mmol/L的儲備液。再分別稀釋成 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、20.0、22.0 μg/mL VC的一系列溶液。

2.4.3 地榆中總?cè)茖PPH自由基清除活性的測定

將“1.3.2.2”項下地榆總?cè)婆涑蓾舛葹?.28、0.67、0.84、1.00、1.12、2.80、5.60、8.40、14.00、16.80、22.40 μg/mL的一系列溶液，取上述樣品溶液2.0 mL，再分別加入DPPH溶液2.0 mL混勻，密封，避光反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測定吸光度（A1），同時以等量乙醇溶液作為空白對照，測定吸光度值A(chǔ)2（即為2 mL的0.13 mmol/L DPPH溶液加入2.0 mL的無水乙醇溶液），測定2 mL的無水乙醇溶液和2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品液混合液的吸光度為A0。根據(jù)下面的公式計算清除率及IC50。

式中：A2為2 mL DPPH溶液中加入2 mL的無水乙醇的吸光度；A1為2 mL DPPH溶液中加入2 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液的吸光度；A0為2 mL無水乙醇中加入2 mL不同質(zhì)量濃度樣品液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計對比分析

采用Microsoft Excel 2010進行統(tǒng)計以及圖標(biāo)的建立；半數(shù)清除率IC50采用SPSS 22.0軟件計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以熊果酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，制定熊果酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得線性回歸方程y=0.008 3x-0.065 8，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 1（n=8），在30 μg/mL～100 μg/mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 熊果酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of ursolic acid solution

2.2 精密度試驗

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密度試驗結(jié)果見表1，計算RSD值為1.4%（n=6），表明該試驗精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果Table 1 The results of precision density experimental

2.3 穩(wěn)定性試驗

地榆回流提取法所制得的樣品溶液的穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表2，計算RSD值為0.81%（n=6），表明該樣品顯色后的吸光度值在125 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 The results of the stability experimental

2.4 重復(fù)性試驗

地榆回流提取法所制得的樣品溶液的重復(fù)性試驗結(jié)果見表3，計算RSD值為0.87%（n=6），表明該試驗重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 The results of repeated experimental

2.5 加樣回收率試驗

地榆回流提取法所制得的樣品溶液的加樣回收率試驗結(jié)果見表4，計算平均加樣回收率為93.85%，RSD值為1.7%（n=6），表明該試驗加樣回收率較好。

2.6 地榆總?cè)坪繙y定

水煮醇沉法、回流提取法、浸漬法所得地榆總?cè)坪繛椋?4.31±0.82）、（88.66±1.70）、（55.26±0.21）mg/g，（n=3）?；亓魈崛》ㄋ玫赜芸?cè)坪棵黠@高于水煮醇沉法和浸漬法。地榆總?cè)坪繙y定結(jié)果見表5。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果Table 4 The results of sample recovery experimental

表5 總?cè)坪繙y定結(jié)果Table 5 The results of total triterpenoids content determination

2.7 DPPH自由基清除作用的測定

不同質(zhì)量濃度的地榆總?cè)啤φ掌稸C溶液對DPPH自由基清除率結(jié)果見圖2。

圖2 地榆總?cè)坪蚔C對DPPH自由基的清除作用Fig.2 The scavenging effect of total triterpenoids and ascorbic acid on DPPH radical

在濃度 1 μg/mL～ 10.0 μg/mL 范圍內(nèi)，樣品清除能力隨總?cè)茲舛鹊纳叨鰪?，?dāng)樣品濃度為5.60 μg/mL時其清除率達91.00%，但隨著濃度的增加，清除率增加不明顯，并趨于平衡。相同條件下，VC濃度為6.00 μg/mL時，其清除率為52.20%。根據(jù)SPSS 22.0軟件數(shù)據(jù)分析，地榆總?cè)频腎C50為3.04μg/mL，對照品VC的IC50為5.46μg/mL，結(jié)果表明，地榆總?cè)魄宄鼶PPH自由基的能力優(yōu)于對照品VC，具有很強的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本試驗采用回流提取法、冷浸法、水煮醇沉法提取地榆總?cè)疲?種提取方法所得提取物總?cè)坪看笮∫来螢椋夯亓魈崛》ǎ?8.66 mg/g）＞浸漬法（55.26 mg/g）＞水煮醇沉法（44.31 mg/g）?；亓魈崛》ㄋ玫赜芸?cè)坪孔罡撸赡苁且驗槿埔兹苡谝掖?，乙醇能與藥材充分接觸，同時加熱也使得總?cè)迫芙舛仍龃?，從而?dǎo)致提取效率增加；若稍加改造其方法如增加回流時間等，提取率將會提高；也可能與操作步驟有關(guān)，回流提取法步驟簡單，減少在轉(zhuǎn)移過程中的損失；而水煮醇沉法操作復(fù)雜，雜質(zhì)較多，可能含有糖類、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，難以去除。綜合考慮，乙醇回流提取法提取地榆總?cè)菩Ч罴眩唵我仔?，便于實現(xiàn)。

對最佳提取方法下提取得到的地榆總?cè)七M行體外抗氧化活性評價，其對DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50值為3.04 μg/mL；對照品VC對DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50值為5.46 μg/mL，表明地榆總?cè)频目寡趸钚詢?yōu)于VC，且隨著地榆總?cè)茲舛鹊脑黾涌寡趸钚詴S之增強，這可能是與三萜化合物及其衍生物協(xié)同作用的結(jié)果。抗氧化活性分析表明，地榆總?cè)凭哂休^強的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑，為開發(fā)利用地榆資源提供一定參考。