超臨界流體工藝萃取茶葉香氣成分

張琪，劉珺，呂玉憲，朱運(yùn)華，呂虎，*

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330022；2.江西省桑蠶茶葉研究所，江西南昌330202）

香氣是茶葉最重要的品質(zhì)之一，茶葉的香氣物質(zhì)在茶葉產(chǎn)業(yè)中一直被人們所重視。在茶葉深加工過程中，茶葉的香氣物質(zhì)損失影響產(chǎn)品的質(zhì)量和風(fēng)味，這一問題一直困擾著茶葉深加工產(chǎn)業(yè)。開發(fā)高效的萃取方法，能最大限度保留茶葉香氣物質(zhì)，對提高茶葉深加工品的質(zhì)量具有重要意義。目前用于茶葉香氣物質(zhì)的萃取方法有同時(shí)蒸餾萃取法（simultaneous distillation extraction，SDE）、固相微萃取法（solid-phase microextraction，SPME）、減壓蒸餾萃取法（vaccum distillation extract，VDE）、頂空吸附法等。SDE可得到較多的香氣物質(zhì)總量和種類[1]，但會產(chǎn)生一些新的揮發(fā)性衍生物[2]，所得精油有焦煳味，香氣嚴(yán)重失真[3]；SPME能夠避免茶葉中香氣組分被破壞，但提取率很低，常用于茶葉香氣成分的分析[4-5]。VDE的試樣和試劑的消耗量大且樣品處理周期長，同時(shí)該方法萃取劑大多采用有毒有害試劑，不能應(yīng)用在食品加工過程。頂空吸附法雖然能極大程度的反映茶葉本身的香氣[6]，由于萃取量小，通常只用于揮發(fā)性成分的分析。國內(nèi)外關(guān)于提取茶葉香氣成分的工藝制備的研究少見報(bào)道。

CO2超臨界流體萃?。╯upercritical fluid extraction，SFE）萃取工藝選擇性好，不僅可以極大程度保留茶葉的原香，且處理量大、萃取率高，還有無溶劑殘留以及節(jié)能環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn)。本文以茶葉浸膏萃取率為主要考察指標(biāo)，以感官評定（與原茶香氣嗅味比較）為次要考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對CO2SFE工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

參考NY/T 2943-2016《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》的方法，2017年4月采摘春季的l芽2葉，按茶樣提供廠家自身的生產(chǎn)方法制備干茶茶樣。

前嶺銀毫茶：江西省蠶桑茶葉研究所提供。CO2鋼瓶氣：南昌氮肥廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Sartorius電子分析天平：德國 Sartorius公司；GC6890-MS5973N型氣相色譜-質(zhì)譜儀：美國Agilent公司；HL-（5+1）L/50-ⅢBQ型超臨界流體萃取裝置：杭州華黎泵業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉精油的萃取

茶葉精油的萃取方法參考文獻(xiàn)[6]。

1.3.2 茶葉精油成分的氣相色譜-質(zhì)譜分析（gas chromatography-mass spectrometric analysis，GC-MS）

通過用質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist 2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，分析得到的總離子流色譜圖中各色譜峰的質(zhì)譜信息，確定每個(gè)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。各香氣成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為各色譜峰的峰面積與總峰面積的比值[6]。

1.4 茶葉精油的感官評定方法

稱取原茶試樣3.00 g，置于150 mL容量的評茶杯中，注滿沸水，加蓋，沖泡5 min后，將茶湯瀝入審評香氣；同時(shí)吸取0.5 g提取的精油樣品置于150 mL容量的評茶杯中，注滿沸水，1 min～2 min后審評香氣，并與原茶進(jìn)行比較。由5位具有國家級資質(zhì)的高級評茶師對提取精油與原茶樣品的香氣特色進(jìn)行評分，對茶精油樣品的顯著特征進(jìn)行描述。評分標(biāo)準(zhǔn)詳見國標(biāo)GB/T 23776-2009《茶葉感官評審方法》[7]。

1.5 單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察壓力（10、15、20、25、30、35 MPa）、溫度（35、40、45、50、55 ℃）、CO2流量（5、6、7、8、9 L/h）、萃取時(shí)間（1、2、3、4、5、6 h）這 4 個(gè)單因素對精油萃取率的影響。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定正交試驗(yàn)因素水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)安排正交試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)L（934）因素水平表Table 1Factors and levels of orthogonal experiment L（934）

1.6 復(fù)合萃取時(shí)間因素優(yōu)化

運(yùn)用SPSS19.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素、多因素方差分析處理，確定萃取的最佳參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取壓力對茶葉精油產(chǎn)率的影響

50℃、CO2流量6 L/h條件下萃取1 h，不同的萃取壓力對茶葉精油產(chǎn)率的影響見圖1。

圖1 不同壓力對對茶葉精油產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of different pressures on extraction yield of tea essential oil

由圖1可知，隨著萃取壓力的升高，產(chǎn)率持續(xù)上升并逐漸趨于平緩。首先，在一定壓力范圍內(nèi)，增加萃取壓力，超臨界CO2的密度隨之增大，茶葉與CO2的接觸面積增大，引起被萃取物的溶解度和傳質(zhì)效率增加，其次是揮發(fā)性物質(zhì)隨壓力增大而揮發(fā)性增強(qiáng)，這二者均有利于萃取。但壓力超過一定范圍后，超臨界CO2的密度隨著壓力的升高而增加的速率降低，且高壓對儀器設(shè)備的要求也逐漸變高。劉佳等[8]的研究結(jié)果也支持本文觀點(diǎn)，結(jié)合圖1，得到較佳的萃取壓力為25MPa。

2.2 萃取溫度對茶葉精油產(chǎn)率的影響

20 MPa、CO2流量6 L/h條件下萃取1 h，不同的萃取溫度對茶葉精油產(chǎn)率的影響見圖2。

圖2 不同溫度對茶葉精油產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of different temperatures on extraction yield of tea essential oil

由圖2可知，隨著溫度的升高，產(chǎn)率先上升后下降。溫度也是影響CO2超臨界流體萃取效率的關(guān)鍵因素之一，其影響具有兩面性。一方面，溫度的升高，增加溶劑的揮發(fā)與擴(kuò)散，同時(shí)升高溫度，有助于增加分子間的締合幾率，使得傳質(zhì)系數(shù)增加，促進(jìn)了產(chǎn)率的提高；另一方面，隨著溫度繼續(xù)升高，超臨界CO2的分子間距增加，使得超臨界CO2的密度降低，減少被萃取物的溶解度，傳質(zhì)效率降低，產(chǎn)率下降，而且過高的溫度會導(dǎo)致香氣物質(zhì)中的損失進(jìn)一步加劇。由圖2可知，溫度低于50℃時(shí)，溫度對于傳質(zhì)系數(shù)的影響處于優(yōu)勢，而當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，產(chǎn)率明顯降低。得到較佳的萃取溫度為50℃。

2.3 CO2流量對茶葉精油產(chǎn)率的影響

20 MPa、50℃、萃取 1 h 條件下，改變 CO2流量對茶葉精油產(chǎn)率的影響見圖3。

圖3 不同CO2流量對茶葉精油產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of different CO2flow rates on extraction yield of tea essential oil

隨著CO2流量的增大，產(chǎn)率緩慢上升并趨于平緩，整體來說影響不大。一方面，增大CO2流量，由于卷吸效應(yīng)[9]，使得被萃取物與超臨界CO2充分接觸混合，提高了產(chǎn)率；另一方面，CO2流量的增大，被萃取物與超臨界CO2接觸時(shí)間縮減，傳質(zhì)過程不充分，降低了產(chǎn)率[10]。由圖3可知，在CO2流量為8L/h時(shí)，其產(chǎn)率達(dá)到最高，可能是卷吸效應(yīng)與接觸時(shí)間縮減達(dá)到平衡所致。

2.4 萃取時(shí)間對茶葉精油產(chǎn)率的影響

20 MPa、50℃、CO2流量 6 L/h 條件下，萃取不同時(shí)間對茶葉精油產(chǎn)率的影響見圖4。

圖4 不同萃取時(shí)間對茶葉精油產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of different extraction time on extraction yield of tea essential oil

由圖4可知，在最初的1 h～3 h，萃取率隨著時(shí)間增加而增加明顯，3 h后萃取率增加趨緩，4 h后萃取率未見增加。萃取時(shí)間對于產(chǎn)率的影響具有條件性，即其只在一定范圍內(nèi)對產(chǎn)率有顯著影響。萃取初始階段，隨著萃取時(shí)間越長，被萃取物與超臨界CO2的接觸混合越充分，產(chǎn)率越高；萃取后期，被萃取物與超臨界CO2已經(jīng)充分接觸混合，產(chǎn)率達(dá)趨于最高值，時(shí)間的延長并不等顯著增加產(chǎn)率，同時(shí)，萃取時(shí)間的延長，還會提高萃取的成本。圖4可得，對于茶葉精油的萃取，3 h是一個(gè)合理的萃取時(shí)間，即在控制成本的前提下盡可能多的提高產(chǎn)率。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)影響CO2SFE的單因素結(jié)果，采用萃取壓力、萃取溫度、CO2流量、萃取時(shí)間4項(xiàng)指標(biāo)，通過L9（34）正交設(shè)計(jì)，測定其組合后對茶葉精油的萃取效果。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

由表2得萃取壓力、溫度、流量、時(shí)間4個(gè)因素的極差分別為 0.27、0.21、0.10、0.79，表明時(shí)間對茶葉精油萃取的影響最大。各因素對萃取率的影響主次為：時(shí)間＞壓力＞溫度＞流量。在壓力25 MPa、溫度45℃、CO2流量8L/h、時(shí)間4h條件下，獲得精油產(chǎn)率為2.57%，確定為較高較佳萃取組合。

2.6 感官評定結(jié)果

在萃取壓力低于25 MPa其他因素不變時(shí)所提取的茶葉精油中，香氣淡薄不及原茶樣品香味濃郁。這可能是因?yàn)閴毫χ饕绊戄腿⌒?，對于茶葉風(fēng)味物質(zhì)各組分的比例無明顯的破壞。在萃取溫度低于45℃、其他因素不變時(shí)所提取的茶葉精油中香短香貧，與原茶樣品香氣有一定差異。但當(dāng)溫度高于50℃，所提取的茶葉精油香味略陳悶，與原茶樣品香氣比較失真較明顯。這可能是其中風(fēng)味峰量組分在這個(gè)溫度范圍內(nèi)損失所致。其他因素相同、CO2流量低于8 L/h的條件中，流量越大，所提取的茶葉精油香氣越清長，越接近原茶樣品香氣；但當(dāng)CO2流量達(dá)到9 L/h時(shí)，所提取的茶葉精油香氣較原茶樣品略有差異。我們認(rèn)為在CO2流量為9 L/h時(shí)，傳質(zhì)過程不充分造成溶解度不同的組分萃取程度不一致，特征香氣物質(zhì)比例發(fā)生變化，造成最后的精油與原茶有差異。在3 h以內(nèi)、其他條件相同，所得到茶葉精油的香氣濃郁度隨著時(shí)間的延長而增加；萃取時(shí)間超過4 h，對于精油的濃郁度無明顯影響，但是香味較原茶樣品有一定的差異[11-15]?？梢?，在3 h內(nèi)，萃取時(shí)間主要影響萃取速率；4 h后則在風(fēng)味物質(zhì)的組分之間的比例上有變化，導(dǎo)致了對香味的影響。

萃取組合為壓力25 MPa、溫度45℃、CO2流量8 L/h、時(shí)間4 h所提取的茶葉精油，有清香高爽，香氣鮮醇，香味保留時(shí)間較長等特點(diǎn)，主要風(fēng)味特點(diǎn)都有體現(xiàn)出來，與原茶風(fēng)味一致。

純CO2SFE萃取茶葉精油成分見表3。

表3 純CO2SFE萃取茶葉精油成分Table 3 Pure CO2SFE extraction of tea essential oil ingredients

續(xù)表3 純CO2SFE萃取茶葉精油成分Table 3 Pure CO2SFE extraction of tea essential oil ingredients

續(xù)表3 純CO2SFE萃取茶葉精油成分Table 3 Pure CO2SFE extraction of tea essential oil ingredients

由表3可知，所得的香氣物質(zhì)中醛類20種，酮類19種，烯烴類17種，醇類14種，烷烴類20種，雜環(huán)類4種，酯類1種，酸類1種，硫醚類1種。其中醛類組分種類最多，醇類含量比例最高占總精油量的27.29%。不同種類物質(zhì)構(gòu)成的特定比例可能決定茶葉特定香氣，黃海濤等[16]認(rèn)為清香型綠茶茶樣的醇類物質(zhì)和烯烴類物質(zhì)含量高，酯類物質(zhì)含量相對較低，這一結(jié)論支持本文觀點(diǎn)。

除了之前討論的峰量物質(zhì)對茶香有巨大貢獻(xiàn)，在茶葉香氣物質(zhì)中，一些含量不高的化合物，其香氣閾值較低，往往在低濃度下也能表現(xiàn)出顯著的香氣，于愛麗等[17]的研究與本文觀點(diǎn)一致，呈現(xiàn)木香、紫羅蘭香的反式-β-紫羅酮在水中的香氣閾值僅為 0.007 μg/L[15，18-19]，對茶香也有較大的香氣貢獻(xiàn)。在本文結(jié)果中，苯甲醇（1.023%）杏呈仁香，2，3-辛二酮（0.93%）有奶油香，苯乙醇（0.617%）呈桃香，雙戊烯（0.507%）有檸檬香味，β-紫羅蘭酮（0.403%）有紫羅蘭香，（-）-α-蓽澄茄油烯（0.394%）有蠟香，這些特征香型的組分因?yàn)楸旧黹撝递^低，所以較少的含量也對茶葉精油的香氣也有很大的作用。王力等[20]分析毛峰綠茶香氣成分，其中苯甲醇、苯乙醇、β-紫羅酮含量較少，這和本文觀點(diǎn)一致。

在萃取中一些些熱敏性香氣成分遇到較高溫度會造成不同程度的破壞，不能反映物質(zhì)的真實(shí)香氣，本文所優(yōu)化的CO2SFE萃取工藝的萃取條件，溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間較短，避免持續(xù)加熱產(chǎn)生了一些氣味不理想的化合物，如在熱作用下氨基酸脫羧，同時(shí)發(fā)生還原等反應(yīng)形成的物質(zhì)[18]，在所得的精油中的吡咯、吡啶、呋喃等含氮化合物種類少，且總含量不足3%，據(jù)報(bào)道這些雜環(huán)化合物有較低的氣味閾值，具有焦糊味，高濃度會有刺激性氣味[19]；本研究提取的精油由于刺激物質(zhì)含量少，劉盼盼等[21]認(rèn)為雜環(huán)化合物與清香、花香呈顯著負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果也支持本文觀點(diǎn)。而酸類化合物大多呈現(xiàn)不愉快的脂味、腐臭味[22]。在精油中，酸類物質(zhì)僅有1種，相對含量很低（0.09%），這也使萃取精油的香氣更好呈現(xiàn)。

3 結(jié)論與討論

本工藝最佳萃取組合為壓力25 MPa、溫度45℃、CO2流量8 L/h、時(shí)間4 h。因?yàn)榫椭兄饕某氏阄镔|(zhì)占有較大的比重而且彼此之間呈現(xiàn)特定的比例，所以得到產(chǎn)物風(fēng)味與原茶香味一致，且提取方式環(huán)保，萃取出的揮發(fā)性成分達(dá)到2.57%，有較高的產(chǎn)率，因此可以用于茶葉香氣物質(zhì)的工藝制備，為茶葉深加工奠定了良好基礎(chǔ)。

迄今從茶葉香氣中分離鑒定出來的有超過600種揮發(fā)性化合物，其中綠茶的主要香韻有花香、清香、甜香、板栗香等[11，24]。綠茶中已分離鑒定出300余種綠茶香氣組分，包括醇類，醛類，酯類，酮類等10余種。這些化合物共同組成青、香、鮮爽的感覺[11，24]。任何一種茶葉的香氣都是所含不同芳香物質(zhì)以不同比例組合的綜合表現(xiàn)，即使一致的茶葉香氣特征香型，其香氣組分或多或少仍存在差異，目前研究者未能確定引起茶葉香型差異的具體物質(zhì)，這也是由茶葉產(chǎn)生香氣過程中復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)、呈香物質(zhì)種類多、含量高低與閾值等多種因素造成的[25]。

茶葉中香氣物質(zhì)可分為非極性親脂性酯類、烯類和弱極性的醇、醛、酮等，加入萃取物親和強(qiáng)的組分，可提高萃取的選擇性和溶解性。黃長修等[26]在萃取鐵觀音香氣物質(zhì)中使用乙醇作為夾帶劑，僅萃取出33種成分。選擇夾帶劑可萃取非極性以及極性香氣物質(zhì)，但夾帶劑添加量把握不當(dāng)會將多余的雜質(zhì)萃取出來，可能影響萃取效率，且夾帶劑的去除過程勢必引起香氣成分的損失。因此，夾帶劑的選擇以及配比還有待考究。