獼猴桃果酒發(fā)酵過程中色澤變化因素的相關(guān)性研究

張鑫，郭雨婷，孫時光，何頌捷，秦世蓉，左勇

（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia），又名奇異果、中國醋梨、羊桃等，為漿果類落葉藤本植物，在世界上多個國家均有種植[1]。獼猴桃果實富含多種氨基酸、礦物質(zhì)、有機酸和VC等，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，有著“VC之王”的美稱[2-3]。目前，獼猴桃在我國的種植面積較大，產(chǎn)量較高且產(chǎn)地過于集中，容易出現(xiàn)鮮果銷售不及時而腐爛浪費的現(xiàn)象[4]。因此，對獼猴桃的精深加工成為了目前急需解決的課題。獼猴桃果酒是以獼猴桃果實為原料，通過發(fā)酵釀制而成的一種低度果酒，因其口感獨特、香氣怡人、營養(yǎng)豐富而受到廣大消費者的青睞。

果酒的色澤是產(chǎn)品重要的感官指標之一，會影響消費者對產(chǎn)品的接受程度。獼猴桃是少數(shù)幾種成熟后依然呈鮮綠色的水果之一，這種鮮綠色主要來源其果實中富含的葉綠素。但是在獼猴桃果酒發(fā)酵過程中，獼猴桃固有的鮮綠色在遭到了破壞的同時，生成許多褐色或黑色物質(zhì)，使獼猴桃果酒呈現(xiàn)黃褐色，嚴重影響果酒品質(zhì)。目前國內(nèi)外對于獼猴桃酒的研究主要集中在釀造工藝的優(yōu)化和香氣成分的分析，對于獼猴桃果酒發(fā)酵過程中色澤變化的研究尚不多見[5-8]。試驗通過監(jiān)測獼猴桃果酒發(fā)酵過程中色澤、多酚氧化酶、過氧化物酶、葉綠素、總酚、黃酮、VC等物質(zhì)的變化情況，結(jié)合統(tǒng)計分析，探究其影響色澤的主要因素，為進一步控制獼猴桃果酒的色澤變化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠心獼猴桃、白砂糖：市售；活性干酵母：湖北安琪酵母公司；果膠酶（5萬U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；鄰苯二酚（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司；蘆丁標準品（99%）：上海國藥集團；葡萄糖、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、重鉻酸鉀、福林酚、焦性沒食子酸、無水碳酸鈉、愈創(chuàng)木酚、抗壞血酸、硫酸、硫酸銅（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-250-HS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：韶關(guān)廣智科技設(shè)備公司；TG-16醫(yī)用離心機：上海安信有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：上海普析通用儀器有限公司；UltraScan VIS臺式色差儀：美國HunterLab有限公司；JYZ-E3榨汁機：山東九陽小家電公司。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃果酒釀造

獼猴桃鮮果→挑選→清洗→打漿（加入SO2）→酶解→接種酵母→前發(fā)酵→倒罐→后發(fā)酵→陳釀→降酸→過濾→調(diào)配→密封裝瓶→果酒成品

1.3.2 主要操作要點

1）獼猴桃的前處理、打漿、酶解：選擇八成熟無病蟲且飽滿完整的獼猴桃果，用清水沖洗后加入SO2打漿，向果漿中加入果膠酶，酶解期間每隔2 h攪拌一次。

2）前發(fā)酵：用蔗糖將果汁總糖調(diào)節(jié)至200 g/L后接種酵母，酵母接種比例為0.2 g/L，接種前活化；發(fā)酵溫度在（20±2）℃內(nèi)。

3）后發(fā)酵：前發(fā)酵結(jié)束后倒罐，將果酒倒出，封罐后進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在（16±1）℃，直至總糖含量低于4 g/L，過濾后在20℃環(huán)境下陳釀[4]。

在發(fā)酵過程中前發(fā)酵期間（0～10 d）每隔24 h取樣，后發(fā)酵期間（10 d～20 d）每隔48 h取樣分析。

1.3.3 色度測定

以透射模式 10°觀察模式測定樣品 L*、a*、b*值；其中L*表示亮度值（0為黑色，100為白色），a*值表示綠紅值（a*＞0為紅色，a*＜0 為綠色），b*表示藍黃值（b*＞0為黃色，b*＜0為藍色）；用 dE（色差值）描述樣品的顏色變化，計算公式如下[9]：

1.3.4 葉綠素含量的測定

葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量：紫外分光光度法[10]。

1.3.5 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性的測定

3 mL反應體系中，包括0.1 mol/L的鄰苯二酚1 mL，pH6.5的磷酸緩沖液1.9 mL和0.1 mL獼猴桃酒樣。將其置于410 nm波長下，從獼猴桃果酒加入開始計時，每30 s記錄一次OD410值以最初直線段的斜率計算酶活力，表示為A410。

1.3.6 過氧化物酶（peroxidase，POD）活性的測定

1）反應液制備：在 100 mL，pH6.0、0.1 mol/L 磷酸緩沖溶液中，加入0.5 mL愈創(chuàng)木酚和1 mL體積分數(shù)為 30%的 H2O2。

2）測定：試管中加入3 mL反應液和0.1 mL獼猴桃酒樣，立即搖勻并迅速倒入比色皿中，于470 nm波長下記錄吸光度的變化值，每30 s記錄一次，共記錄3 min，即A470。以不添加任何酶液的反應體系為對照。以A470值表示過氧化物POD的酶活性。

1.3.7 總酚含量的測定

Folin-酚法，標準曲線回歸方程：y=1.327 1x+0.014 5，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3。

1.3.8 黃酮含量的測定[11]

1）標準曲線的制作：將蘆丁標準品（純度高于99%）在110℃溫度下干燥至恒重，準確稱取50.00 mg，用體積分數(shù)為80%的乙醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并用體積分數(shù)為80%的乙醇溶液定容至刻度，即500 mg/L蘆丁標準溶液。取5支50 mL容量瓶分別加入1、2、3、5、10 mL蘆丁標準溶液，然后分別加入質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO2溶液1mL，混勻后靜置6 min；然后分別加入質(zhì)量分數(shù)為10%的Al（NO3）3溶液1 mL，混勻后靜置6 min；隨后分別加入質(zhì)量分數(shù)為4%的NaOH溶液10 mL；最后用體積分數(shù)為80%的乙醇溶液定容至50 mL，混勻后靜置12 min后在510 nm波長下測定OD值，以蘆丁含量（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，繪制蘆丁的標準曲線；標準曲線回歸方程為：y=0.082 1x-0.003 9，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 2。

2）樣品測定：用移液管準確移取3份過濾好的獼猴桃酒樣5 mL，于50 mL容量瓶中，分別加入5 mL蒸餾水以稀釋酒樣。第一份直接用體積分數(shù)為80%的乙醇溶液定容至50 mL，以作對照。其他兩份然后分別加入質(zhì)量分數(shù)為5%NaNO2的溶液1 mL，混勻后靜置6 min；然后分別加入質(zhì)量分數(shù)為10%Al（NO3）3的溶液1 mL，混勻后靜置6 min；隨后分別加入質(zhì)量分數(shù)為4%的NaOH溶液10 mL；最后用體積分數(shù)為80%的乙醇溶液定容至50 mL，混勻后靜置12 min后在510 nm波長下測定OD值，并根據(jù)上述的標準曲線回歸方程，計算出獼猴桃酒樣中的總黃酮含量。

1.3.9 VC測定

參照王海佳的方法[12]。

1.3.10 5-羥甲基糠醛 （5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）含量的測定

5-HMF含量的測定參考薛楚然的方法[13]，標準曲線回歸方程為：y=0.106 8x+0.038，相關(guān)系數(shù)R2=0.997。

1.4 試驗數(shù)據(jù)與結(jié)果處理

每組試驗做3次平行，試驗結(jié)果均以x±sd表示。采用Origin 2018軟件繪制圖表，SPSS 20軟件進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中色度變化情況

對于獼猴桃果酒，其色澤是衡量產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標，將直接影響消費者的接受度。獼猴桃果酒發(fā)酵過程中色度變化見圖1。

圖1 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中色度的變化Fig.1 Changes in chroma during the fermentation of kiwi wine

如圖1所示，獼猴桃果酒的色澤變化主要發(fā)生在主發(fā)酵階段（0～10 d）：色差值dE從0上升到了47.05；其中a*值代表了獼猴桃果酒的紅綠色調(diào)（a*＞0紅色色調(diào)、a*＜0 代表綠色），a*值從-7.3 上升到了-1.55，這說明獼猴桃果汁固有的鮮綠色遭到了極大的破壞；b*值代表了黃藍色調(diào)（b*＞0黃色色調(diào)、b*＜0藍色色調(diào)），呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第4天達到了最高值，從45.58下降到了21.09，說明在發(fā)酵過程中也引起了果肉黃色的顯著損失。在后發(fā)酵階段（10 d～20 d），獼猴桃果酒的色澤進一步發(fā)生變化：dE從47.05上升到了57.68；a*從-1.55上升到了-0.03，果酒綠色色調(diào)基本消失；b*從21.09下降到了13.67，果酒酒體由淡黃色呈現(xiàn)為黃褐色。

2.2 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中葉綠素含量變化情況

葉綠素是獼猴桃及其制品的主要呈色物質(zhì)，綠色值（-a*）是評價果漿綠色的感官指標，在獼猴桃果漿加工中要綜合考慮葉綠素含量和綠色的保留[14-16]，獼猴桃果酒發(fā)酵過程中葉綠素含量變化見圖2。

圖2 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中葉綠素含量的變化Fig.2 Changes of chlorophyll content during the fermentation of kiwi wine

由圖2可以看出，在獼猴桃果酒發(fā)酵過程中，葉綠素一直處于下降的趨勢，其中在主發(fā)酵階段葉綠素的含量迅速下降，與獼猴桃果酒的色澤中a*值的變化呈負相關(guān)。其原因在于，葉綠素的性質(zhì)極不穩(wěn)定，容易受到外界條件如光、溫度和酸性物質(zhì)等的干擾而發(fā)生降解；另外由于獼猴桃本身屬于酸性物質(zhì)，在果漿破碎后大量的空氣進入漿果中也引起了葉綠素氧化而被降解，導致果酒原本的鮮綠色消失。因此，在獼猴桃果酒的發(fā)酵過程中，應在保證產(chǎn)品品質(zhì)的基礎(chǔ)上，控制合適的發(fā)酵條件（如溫度、光照、pH值等），盡量減少其色素的降解。

2.3 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中多酚氧化酶活性變化情況

由于多酚氧化酶能夠在氧參與的情況下把多酚類物質(zhì)氧化成對應的醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)會進一步聚合形成黑色素，影響果酒色澤和品質(zhì)，獼猴桃果酒發(fā)酵過程中多酚氧化酶活性變化見圖3。

圖3 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中多酚氧化酶活性的變化Fig.3 Changes in polyphenol oxidase activity during the fermentation of kiwi wine

從圖3可以看出，多酚氧化酶的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在獼猴桃果酒發(fā)酵的前兩天，由于獼猴桃果汁破碎處理后，細胞遭到破壞，細胞內(nèi)的多酚氧化酶釋放并與底物和氧氣充分接觸，使其活性升高。隨著酒精發(fā)酵過程的開始，氧氣被進一步消耗，與此同時生成的CO2將果酒中的氧氣排出，使得多酚氧化酶的活性被逐漸抑制。倒罐后，由于再次添加了亞硫酸鉀，游離出的SO2進一步抑制了多酚氧化酶的活性，因此在后發(fā)酵后期，多酚氧化酶的活性會逐步趨于穩(wěn)定[9]。

2.4 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中過氧化物酶活性變化情況

過氧化物酶能夠與多酚氧化酶一起催化多酚類物質(zhì)，導致其生成醌類物質(zhì)進一步聚合形成黑色素。此外，過氧化物酶也可以參與VC的氧化反應，進一步促進褐變。獼猴桃果酒發(fā)酵過程中過氧化物酶活性含量變化見圖4。

圖4 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中過氧化物酶活性的變化Fig.4 Changes in peroxidase activity during the fermentation of kiwi wine

如圖4所示，過氧化物酶活性的變化與多酚氧化酶活性變化基本相似，總體處于先升高后降低的趨勢。過氧化物酶的活性在第3天達到最高值，此后其活性迅速下降；進入后發(fā)酵階段，過氧化物酶的活性逐漸趨于穩(wěn)定。倒罐后添加的SO2同樣會限制過氧化物酶的活性，使其在后發(fā)酵階段逐漸趨于穩(wěn)定。

2.5 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中總酚和黃酮含量變化情況

在獼猴桃果酒的發(fā)酵過程中，獼猴桃皮渣在獼猴桃汁中不斷浸漬，逐漸釋放單寧等多酚類物質(zhì)及黃酮。獼猴桃果酒發(fā)酵過程中總酚和黃酮含量變化見圖5。

如圖5所示，總酚和黃酮含量在獼猴桃果酒發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢。在發(fā)酵的前6 d，總酚和黃酮含量快速上升，增幅分別達到40%和248%，此后，直到發(fā)酵結(jié)束，總酚含量逐漸降低，較發(fā)酵開始時下降了約10%，黃酮含量較發(fā)酵開始時上升了8%。原因在于，在發(fā)酵前期，獼猴桃皮渣中的多酚和黃酮類物質(zhì)迅速浸出并溶入發(fā)酵醪中，使發(fā)酵液中的總酚和黃酮含量升高；隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中酚類與黃酮類物質(zhì)逐漸趨于平衡，含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢；伴隨著發(fā)酵醪中的皮渣分離后，酚類與黃酮類物質(zhì)被氧化分解，使總酚和黃酮含量進一步下降，這與王行等的研究結(jié)果一致[17]。

圖5 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中總酚和黃酮含量的變化Fig.5 Changes in total phenolic and flavonoid content during the fermentation of kiwi wine

2.6 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中VC含量變化情況

獼猴桃果實中富含豐富的VC，是其鮮果營養(yǎng)價值高的重要原因之一，此外VC也常常作為添加劑與檸檬酸配合用來抑制酶促褐變，但添加使用不當，抗壞血酸的氧化褐變反過來又會影響產(chǎn)品的色澤。獼猴桃果酒發(fā)酵過程中VC含量變化見圖6。

圖6 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中抗壞血酸含量的變化Fig.6 Change of ascorbic acid content during the fermentation of kiwi wine

從圖6可以看出，發(fā)酵階段開始后VC含量一直處于下降的趨勢，由發(fā)酵開始時的444 mg/L下降到了368 mg/L。在獼猴桃果酒發(fā)酵過程中，VC的降解途徑主要分為有氧降解和無氧降解：有氧降解過程中，VC被氧化成為脫氫抗壞血酸，與氧氣進一步結(jié)合后被氧化成二酮基古洛糖酸，二酮基古洛糖酸脫羥基后成為羥基糠醛；無氧降解過程中，脫氫抗壞血酸在CO2的作用下形成糠醛物質(zhì)[18-19]，羥基糠醛可聚合成為褐色物質(zhì)影響果酒色澤。

2.7 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量變化情況

美拉德反應、抗壞血酸氧化分解、焦糖化反應和多元酚氧化縮合反應4種反應都會形成一種共同的中間產(chǎn)物—羥甲基糠醛（HMF），因此，通常將5-HMF作為評價產(chǎn)品非酶褐變及程度的指標。獼猴桃果酒發(fā)酵過程中5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量變化見圖7。

圖7 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中5-HMF含量的變化Fig.7 Changes of 5-HMF content during the fermentation of kiwi wine

如圖7所示，在主發(fā)酵階段，5-HMF含量的變化十分顯著，在發(fā)酵前兩天，5-HMF含量從最初的0.6 μg/mL迅速上升達到1.91 μg/mL，然后其含量迅速下降，在第7天含量為0.65 μg/mL，與發(fā)酵開始時含量相差不大。進入后發(fā)酵階段，5-HMF的含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，至發(fā)酵結(jié)束其含量為0.34 μg/mL。分析其原因認為是，發(fā)酵前期由于美拉德反應后階段的縮合反應速率較慢，生成的5-HMF主要用于積累，故表現(xiàn)為增加趨勢；到了發(fā)酵后期，果糖與葡萄糖參與美拉德反應速率變慢，使5-HMF生成量減少，5-HMF的消耗速率大于積累速率，含量因此不斷減少。

2.8 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中褐變因素與色度（dE*）相關(guān)性分析

利用SPSS 20軟件，將研究中測定的各項指標與色度進行皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果見表1。

表1 獼猴桃果酒發(fā)酵過程中褐變因素與色度（dE）相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of browning and browning degree（dE）in kiwi wine fermentation

由表1可以看出，在獼猴桃果酒發(fā)酵過程中，與色度（dE）呈極顯著相關(guān)的因素分別是葉綠素、多酚氧化酶（PPO）、抗壞血酸、過氧化物酶（POD）和總酚。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，多酚氧化酶（PPO）和葉綠素對獼猴桃果酒發(fā)酵過程中色澤變化影響最大，其次是抗壞血酸、POD、總酚，5-HMF和黃酮對獼猴桃果酒的色澤變化影響較小。

3 結(jié)論

獼猴桃果酒在發(fā)酵過程中，其色澤由最初的鮮綠色變?yōu)辄S綠色再轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色，其色澤變化情況十分嚴重；色差值與葉綠素和PPO呈極顯著相關(guān)（p＜0.01），其相關(guān)系數(shù)分別達到-0.941和-0.902，這說明引起獼猴桃果酒色澤變化的主要因素是色素的降解和酶促褐變。色差值與抗壞血酸、POD和總酚含量也呈負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性極顯著（p＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.856、-0.809和-0.749，說明引起獼猴桃果酒色澤變化的次要因素是抗壞血酸反應與非酶促褐變。

對于獼猴桃果酒的護色應該主要圍繞其葉綠素的特性來優(yōu)化發(fā)酵工藝，以及添加適當?shù)碾x子抑制劑使葉綠素形成穩(wěn)定的螯合物。此外，針對獼猴桃果酒容易發(fā)生的酶促褐變可以采用添加酶活性抑制劑來實現(xiàn)酶促褐變的控制。