油菜蜂花粉及其蜂糧不同溶劑提取物抗氧化活性研究

牛德芳，王波，張靜，殷玲，*，劉萍，戰(zhàn)旭梅，陳玉勇

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300；2.黑龍江省蠶業(yè)研究所，黑龍江哈爾濱150086）

蜂花粉是指蜜蜂從植物雄蕊采集的花粉粒，經(jīng)過(guò)加入少量花蜜和分泌物混合而成的花粉團(tuán)狀物[1-2]。蜂糧是蜜蜂將采集的蜂花粉儲(chǔ)存在巢房?jī)?nèi)，加入少量的花蜜或蜂蜜，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵而成，是蜜蜂生長(zhǎng)和繁衍后代不可或缺的全價(jià)營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[3-5]。蜂花粉作為一種自然資源，被譽(yù)為“微型營(yíng)養(yǎng)庫(kù)”，不僅富含酚類、類黃酮、蛋白質(zhì)、核酸、脂類、維生素、礦物質(zhì)和微量元素等多種生物活性物質(zhì)，而且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)全面而均衡，且具有低脂肪、高蛋白等特點(diǎn)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，蜂花粉具有抗氧化、抗癌、抗衰老、降低膽固醇和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能，對(duì)心腦血管疾病、癌癥、肝病、胃腸系統(tǒng)疾病等有很好的預(yù)防和改善作用[8-12]。

盡管蜂花粉營(yíng)養(yǎng)如此豐富，功效如此之多，但是在正常蜂群中蜜蜂一般不直接食用蜂花粉，而是將蜂糧作為主要的營(yíng)養(yǎng)源，說(shuō)明蜂糧與蜂花粉相比在某些方面可能更具有優(yōu)越性。國(guó)內(nèi)外關(guān)于蜂糧的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)成分、不同釀制時(shí)間微生物的變化情況以及人工蜂糧的開(kāi)發(fā)利用方面。Loper測(cè)定了手采花粉、蜂花粉（杏仁）和7日、21日、42日蜂糧除脂肪酸和膽固醇外的其他營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)[13]。蘇松坤等對(duì)中國(guó)茶的手采花粉、蜂花粉、不同釀制時(shí)間蜂糧中的營(yíng)養(yǎng)成分和菌落變化進(jìn)行測(cè)定，并獲得天然蜂糧的生產(chǎn)方法[14-16]。袁耀東報(bào)道了蜂糧的成分和作用[17]。楊多福認(rèn)為蜂糧具有奇效[18]。Baltrusaityte等測(cè)定發(fā)現(xiàn)蜂糧樣品中酚類物質(zhì)清除自由基的能力明顯高于蜂蜜樣品[19]。蜂糧作為一種新型營(yíng)養(yǎng)保健品所具有的優(yōu)勢(shì)逐漸成為共識(shí)[20]，并越來(lái)越受到人們的重視。但對(duì)蜂糧的生物學(xué)活性、有效化學(xué)成分等基礎(chǔ)研究不足，造成了蜂糧開(kāi)發(fā)與利用的嚴(yán)重滯后。已有研究發(fā)現(xiàn)蜂花粉具有明顯的體外抗氧化功能[21-24]，其發(fā)揮作用的主要活性物質(zhì)包括黃酮類、多酚類、脂類（類胡蘿卜素）、維生素C、維生素E等[25-28]，但關(guān)于蜂糧體外抗氧化活性的研究尚未有報(bào)道。

本文以油菜蜂花粉及其同種植物源的蜂糧為研究對(duì)象，首次對(duì)油菜蜂花粉及其蜂糧水提物、醇提物體外清除DPPH自由基和ABTS+·的能力進(jìn)行比較研究，以期獲得蜂花粉和蜂糧不同溶劑提取物的體外抗氧化活性，為蜂花粉尤其是蜂糧在抗氧化功能性食品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，對(duì)提高蜂糧的綜合利用率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜蜂花粉和油菜蜂糧，取自江蘇省泰州養(yǎng)蜂場(chǎng)，-20℃保藏。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：美國(guó) Sigma 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LABCONCO-6L真空冷凍干燥機(jī)：上海照生儀器有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TD5A-WS臺(tái)式低速大容量離心機(jī)：金壇市金南儀器制造有限公司。

1.3 水溶性樣品的制備

稱取一定質(zhì)量的油菜蜂花粉和蜂糧樣品，按照料液比1∶20（g/mL）的比例加超純水，40℃條件下超聲輔助提取30 min，并以4 000 r/min離心15 min，取上清液50℃條件下進(jìn)行濃縮后，在真空冷凍干燥機(jī)中凍干獲得蜂花粉和蜂糧的固體水提物，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 醇溶性樣品的制備

稱取一定質(zhì)量的油菜蜂花粉和油菜蜂糧樣品，按照料液比1∶20（g/mL）的比例加 75%乙醇，40℃條件下超聲輔助提取30 min，并以4 000 r/min離心15 min，取上清液50℃條件下進(jìn)行濃縮后，在真空冷凍干燥機(jī)中凍干獲得蜂花粉和蜂糧的固體醇提物，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

用無(wú)水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，置于4℃冰箱避光保存，用時(shí)現(xiàn)配。取不同質(zhì)量濃度的樣品提取物溶液和維生素C溶液5 mL（對(duì)照組），空白使用對(duì)應(yīng)溶劑，分別加入0.2 mmol/L DPPH溶液5 mL，搖勻后室溫避光放置30 min。用75%的乙醇調(diào)零，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度，每個(gè)濃度的樣品平行操作3次，取其平均值。按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A空白是不含提取物空白樣品的吸光度；A樣品是不同質(zhì)量濃度樣品提取溶液的吸光度。

以提取物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程及樣品的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）。

1.6 清除ABTS+·能力的測(cè)定

ABTS工作液的配置參照王雪飛等的方法[24]。取不同質(zhì)量濃度的樣品提取物溶液和維生素C溶液5 mL（對(duì)照組），空白使用對(duì)應(yīng)溶劑，分別加入ABTS工作液5 mL，搖勻后室溫避光放置6 min。用超純水調(diào)零，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定其吸光度，每個(gè)濃度的樣品平行操作3次，取其平均值。按式（2）計(jì)算ABTS+·的清除率。

式中：A空白是不含提取物空白樣品的吸光度；A樣品是不同質(zhì)量濃度樣品提取溶液的吸光度。

以提取物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程及樣品的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用SPSS25.0軟件，差異顯著性水平p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)油菜蜂花粉及其蜂糧的水提物和醇提物體外清除DPPH自由基和ABTS+·的能力，比較其抗氧化活性。

2.1 油菜蜂花粉及其蜂糧水提物和醇取提物對(duì)DPPH自由基的清除能力

油菜蜂花粉與蜂糧不同質(zhì)量濃度水提物和醇提物對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖1所示。

圖1 不同質(zhì)量濃度蜂花粉與蜂糧水提物和醇提物對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rates of water and ethaonlic extracts from bee pollen and bee bread with various concentrations on DPPH free radicals

由圖1可知，各提取物對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除能力，且清除率與各提取物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性。隨著各提取物質(zhì)量濃度的升高，它們對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增大。在各質(zhì)量濃度下，蜂花粉及其蜂糧醇提物的清除率顯著高于水提物（p＜0.05），依次為蜂花粉醇提物＞蜂糧醇提物＞蜂糧水提物＞蜂花粉水提物。在最大質(zhì)量濃度500 μg/mL時(shí)，蜂花粉和蜂糧醇提物的清除率分別為94.2%、73.9%；蜂花粉和蜂糧水提物的清除率分別8.2%和13.4%。

蜂花粉與蜂糧水提物和醇提物清除DPPH自由基的IC50見(jiàn)表1。

表1 蜂花粉與蜂糧水提物和醇提物清除DPPH自由基的IC50Table 1 IC50of water and ethaonlic extracts from bee pollen and bee bread for scavenging DPPH free radicals

由表1可知，蜂花粉及其蜂糧醇提物清除DPPH自由基的IC50值差異不顯著（p＞0.05），與其他兩種提取物清除DPPH自由基的IC50值差異顯著（p＜0.05），4種提取物的抗氧化能力均明顯弱于維生素C。蜂花粉醇提物清除DPPH自由基的IC50值最小，為（0.204±0.001）mg/mL，其次是蜂糧醇提物，清除DPPH自由基的 IC50值為（0.290±0.002）mg/mL，二者的清除能力均遠(yuǎn)強(qiáng)于水提物。蜂花粉及其蜂糧提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的大小關(guān)系為蜂花粉醇提物＞蜂糧醇提物＞蜂糧水提物＞蜂花粉水提物。

2.2 油菜蜂花粉與蜂糧水提物和醇提物對(duì)ABTS+.的清除能力

油菜蜂花粉與蜂糧不同濃度水提物和醇提物對(duì)ABTS+·的清除能力如圖2所示。

圖2 不同質(zhì)量濃度蜂花粉與蜂糧水提物和醇提物對(duì)ABTS+.的清除率Fig.2 Scavenging rates of water and ethaonlic extracts from bee pollen and bee bread with various concentrations against ABTS+·radicals

由圖2可，各提取物對(duì)ABTS+·均具有清除能力，且清除率與各提取物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性。隨著各提取物質(zhì)量濃度的升高，它們對(duì)ABTS+·的清除率逐漸增大。在各質(zhì)量濃度下，蜂花粉和蜂糧醇提物的清除率顯著高于水提物（p＜0.05），依次為蜂糧醇提物＞蜂花粉醇提物＞蜂糧水提物＞蜂花粉水提物。在最大質(zhì)量濃度500 μg/mL時(shí)，蜂花粉和蜂糧醇提物的清除率分別為99.5%和100%；蜂花粉和蜂糧水提物的清除率分別20.8%和34.2%。

蜂花粉與蜂糧水提物和醇提物清除ABTS+·的IC50見(jiàn)表2。

表2 蜂花粉與蜂糧水提物和醇提物清除ABTS+·的IC50Table 2 IC50of water and ethaonlic extracts from bee pollen and bee bread for scavenging ABTS+·radicals

由表2可知，蜂花粉及其蜂糧醇提物清除ABTS+·的 IC50值差異不顯著（p＞0.05），與水體物清除 ABTS+·的IC50值差異顯著（p＜0.05），4種提取物的抗氧化能力均明顯弱于維生素C。蜂糧醇提物清除ABTS+·的IC50值最小，為（0.094±0.003）mg/mL，表明其清除 ABTS+.的能力最強(qiáng)；其次是蜂花粉醇提物，清除ABTS+·的IC50值為（0.167±0.003）mg/mL，二者的清除能力均顯著強(qiáng)于水提物。蜂花粉及其蜂糧提取物對(duì)ABTS+·清除能力的大小關(guān)系為蜂糧醇提物＞蜂花粉醇提物＞蜂糧水提物＞蜂花粉水提物。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)油菜蜂花粉及其蜂糧水提物和醇提物體外清除DPPH自由基和ABTS+·的能力進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，4種提取物中對(duì)DPPH自由基的清除能力依次為蜂花粉醇提物＞蜂糧醇提物＞蜂糧水提物＞蜂花粉水提物；4種提取物對(duì)ABTS+·的清除能力依次為蜂糧醇提物＞蜂花粉醇提物＞蜂糧水提物＞蜂花粉水提物。綜上，蜂花粉及其蜂糧醇提物體外清除DPPH自由基和 ABTS+·的能力顯著高于水提物（p＞0.05），但 2 種醇提物之間清除自由基的能力差異不顯著（p＜0.05），即蜂花粉及其蜂糧醇提物的抗氧化能力顯著高于水提物。已有研究表明，油菜蜂花粉醇提物中主要的抗氧化成分是黃酮類化合物和多酚類物質(zhì)[29-30]，并在體外具有明顯的羥基自由基清除功能[21，31-32]。因此，油菜蜂花粉及其蜂糧醇提物的抗氧化性能可能與提物中黃酮類物質(zhì)和多酚類物質(zhì)有關(guān)，抗氧化能力的大小可能與其含量呈正相關(guān)性。蜂花粉水提物的主要活性成分之一是多糖，研究表明紅花蜂花粉多糖還具有體外清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的作用[33]。本研究表明，蜂花粉及其蜂糧水提物也具有一定程度的體外清除DPPH和ABTS+·的能力，可能與水提物中的多糖成分有關(guān)。綜上，蜂花粉及其蜂糧的4種提取物均具有一定的體外抗氧化活性，具有廣闊的應(yīng)用前景，但是分離純化具體的抗氧化活性因子還需要進(jìn)一步細(xì)致而深入的研究。