一種黑木耳酸性多糖的分離純化及其結(jié)構(gòu)鑒定

苗晶囡，邱軍強，*，李海霞，張華，劉樹民

（1.海南醫(yī)學院藥學院，海南?？?70100；2.哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院，黑龍江哈爾濱150090；3.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱150090）

黑木耳（Auricularia auricula）為屬真菌類擔子菌綱，是生長在朽木上的一種腐生菌，在我國作為藥食同源真菌被廣泛食用，主要生長于我國東北部的大、小興安嶺山區(qū)[1-2]。黑木耳的營養(yǎng)價值和多種藥理功能引起相關(guān)學者的研究興趣。《本草綱目》中記載：木耳生于朽木之上，性甘平，主治益氣不饑，輕身強志，并有治療痔瘡，血痢，下血等作用。國內(nèi)外文獻報道黑木耳子實體多糖（Auricularia auricula polysaccharide，AAP）具有抗氧化[3]、降血脂[4]、降血糖[5]、抗腫瘤[6]、抗凝血[7]和抗衰老改善心肌功能等活性[8-10]。但是，截止到目前有關(guān)低分子量的黑木耳酸性多糖分離純化及其結(jié)構(gòu)研究罕見報道，通過對低分子量的黑木耳酸性多糖進行提取分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定研究，以期為今后黑木耳多糖的各種生物活性深入研究及開發(fā)利用提供試試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

黑木耳：伊春小興安嶺林場；氫氧化鈉、氯仿、正丁醇、氯化鈉、無水乙醇、高碘酸、三氟乙酸、高碘酸鈉、甲酸、硼氫化鈉、溴甲酚、硫酸、碳酸鋇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：國藥集團化學試劑有限公司；離子交換纖維素（Diethylaminoethyl-52，DEAE-52）、葡聚糖凝膠層析Sephadex G-100：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；標準單糖：美國默克公司。

N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器有限公司；KQ-5200型超聲波清洗器、FW-100型高速萬能粉碎機：天津泰斯特設(shè)備有限公司；PB-10型精密pH計、R200-D型電子分析天平：德國Sartorius公司；FD-1型真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康儀器設(shè)備有限公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒儀器有限公司；GL-10LM型高速冷凍離心機：湖南星科設(shè)備有限公司；TGL-16G型臺式離心機：上海安亭儀器有限公司；Spectrum one FT-IR型傅里葉紅外光譜儀：美國鉑金埃爾默有限公司；Agilent-1100型高效液相色譜儀、Agilent 6890-5973型氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司；Bruker ultrashield-500型核磁共振儀：德國Bruker公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑木耳多糖的提取及乙醇分級沉淀

稱取一定量的黑木耳粉末，按照質(zhì)量濃度為0.012 5 g/mL的比例加入去離子水，440 W超聲處理20 min，使用100℃水浴對黑木耳多糖提取4 h，按照上述提取方法反復提取共3次。合并提取液，并通過離心機4 000 r/min條件下，離心10 min。收集上層提取液，將其在50℃條件下，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，然后向得到的濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇，4℃沉淀過夜。通過離心分離得到乙醇沉淀物，將所得沉淀物依次通過乙醇、丙酮和乙醚進行清洗，一定量去離子水復溶后凍干，得黑木耳粗多糖提取物，即為“黑木耳粗多糖”。

1.2.2 Sevage法除蛋白

取步驟1.2.1所得的黑木耳粗多糖，在50℃的熱水浴中，溶解干燥的粗多糖，然后通過Sevage除蛋白法去除粗多糖中的蛋白質(zhì)，加入5倍體積的Sevage試劑，4 000 r/min離心20 min后，去除變性的蛋白質(zhì)，重復操作3次以上，直至完全除去蛋白質(zhì)成分。將除去蛋白質(zhì)的上清溶液減壓濃縮，加入3倍體積的95%乙醇4℃沉淀24 h，真空冷凍干燥，得到“黑木耳精制多糖”[11]。

1.2.3 乙醇分級

取步驟1.2.2所得的黑木耳精制多糖，在50℃的熱水浴中，溶解干燥的精制多糖，然后通過分別加入一定體積的無水乙醇，使得多糖溶液中的乙醇體積濃度依次達到20%、40%、60%、80%，分別經(jīng)過4 000 r/min離心20 min后，得到的沉淀依次為AAP-20%、AAP-40%、AAP-60%、AAP-80%和AAP-80%以上，將得到的AAP-60%作為后續(xù)研究對象[11]。

1.2.4 DEAE-52離子交換層析

準確量取20.0 g DEAE-52纖維素介質(zhì)，通過適量去離子水浸泡24 h，使得纖維素介質(zhì)得到充分溶脹。除去表面漂浮的顆粒，真空泵過濾吸干水分，然后通過一定體積濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液進行浸泡1 h。采用去離子水洗滌為中性，再分別配制0.5 mol/L的HCl溶液、0.5 mol/L的NaOH溶液，并對介質(zhì)進行活化處理，備用。本試驗采用規(guī)格為2.6 cm×60 cm的玻璃層析柱，徑長比為1∶20，上樣體積為15 mL。采用不同濃度的NaCl溶液對其進行洗脫，依照0～1 mol/L的濃度變化進行逐步洗脫，洗脫流速設(shè)定為0.5 mL/min，采用自動收集器不同階段的洗脫液，按每管10 mL進行收集，通過苯酚硫酸法對洗脫餾分進行分析[12]。

1.2.5 Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析

精確量取30.0 g的葡聚糖凝膠Sephadex G-100，取一定體積的去離子水對介質(zhì)進行溶脹48 h，棄去溶液中的懸浮顆粒。按照葡聚糖凝膠的理化性質(zhì)，選擇玻璃層析柱的尺寸為3.0 cm×100 cm，上樣體積為15.0 mL，上樣濃度設(shè)定為 1.0 mg/mL，徑長比為 1∶18，以蒸餾水作為洗脫液，洗脫流速設(shè)置為0.5 mL/min。將離子交換層析分離獲得的多糖樣品再通過葡聚糖凝膠層析進行分離，自動收集器對洗脫餾分進行收集，每管10 mL，采用苯酚硫酸法對洗脫液進行分析[13]。

1.2.6 黑木耳多糖的特性黏度及黏均分子量測定

精確稱取適量黑木耳多糖樣品，室溫將其溶解于一定體積蒸餾水中，0.22 μm濾膜過濾，將規(guī)格為0.5 mm～0.6 mm的烏氏黏度計置于水浴裝置中保持溫度恒定為25℃，通過梯度稀釋的方法測量多糖溶液和水在黏度計中的流出時間，每個樣品同一濃度重復測量3次。特性黏度[η]的值根據(jù)哈金斯（Huggins）方程計算得到[14]，同時根據(jù)馬克霍溫克方程特性推導黏均分子量。

式中：c為樣品的濃度，g/mL；K為哈金斯常數(shù)，單位；η為樣品的特性黏度，dL/g。ηsp為樣品的增比黏度。

1.2.7 黑木耳多糖的紅外光譜分析

準確稱取5.0 mg的AAP，然后將其分別與76 μm的KBr粉末300.0 mg進行混合，在紅外燈下用瑪瑙乳缽進行研磨，將混合物裝入到壓片模具中，在抽真空條件下用油壓機以27 MPa的壓力進行壓片，在4 000 cm-1～400 cm-1處進行紅外光譜掃描。

1.2.8 黑木耳多糖的高效液相色譜分析

將得到的多糖用流動相配制成2 mg/mL的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，高效液相色譜示差檢分析，進樣量為20 μL。Waters高效液相色譜系統(tǒng)（2996泵，2414示差檢測器），Shodex sugar KS-805+保護柱KS-G高效凝膠過濾色譜柱，流動相為超純水，柱溫30℃，流速0.8 mL/min。進行高效液相色譜法測定，記錄色譜圖。

1.2.9 黑木耳多糖的單糖組成分析

單糖液相工作液的制備：依次精確稱取7種單糖對照品（L-鼠李糖，D-葡萄糖，D-木糖，D-核糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-甘露糖）各0.100 2 g，使用去離子水依次定容至100 mL。依次吸取單糖工作液0.25、0.50、2.50、5.00、10.00 mL，移入 10 mL 棕色容量瓶中，去離子水定容，最后得到終濃度依次為0.025、0.050、0.250、0.500、1.000 mg/mL的單糖標準工作液。

多糖樣品水解過程如下：將多糖（15.0 mg）置于4 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸溶液中，通入氮氣，立即進行試管封口，110℃條件下水解4 h。然后等待試管冷卻至常溫，將水解液在50℃以下減壓濃縮蒸干，然后用3 mL甲醇對樣品進行溶解，氮氣吹干，對上述操作進行重復4次～5次，從而徹底去除三氟乙酸。

單糖乙酰化：通過3 mL的蒸餾水將多糖的水解產(chǎn)物或單糖混標溶液進行溶解，接著通過加入30.0 mg硼氫化鈉還原3 h，在還原過程中保證間歇震蕩，促使反應完全。待反應完全結(jié)束，吸取幾滴冰醋酸滴加到反應液中，使得上述溶液中沒有氣泡，然后棄去過量的硼氫化鈉，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器50℃左右將反應液減壓蒸干，通過4 mL的甲醇進行溶解，接著采用氮吹設(shè)備除去甲醇，反復進行上述操作4次～5次，完全除去硼酸根。將樣品置于110℃烘箱中30 min，從而脫去樣品中的水分。冷卻至室溫后滴加3 mL乙酸酐和1 mL的吡啶，在100℃高溫條件下反應3 h～5 h，待沉淀完全消失后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器80℃將反應液減壓蒸干，然后滴加5 mL氯仿定容。并加入相同量的去離子水洗滌2次～3次，棄去多余的乙酸酐，最后放入無水硫酸鈉脫去水分，0.45 μm濾膜過濾，上機。

色譜條件為色譜柱：DB-5彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序設(shè)置：初始200℃，25℃/min至 250℃，持續(xù) 10 min；載氣：He；進樣量：1 μL；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃，分流比：1∶10。

質(zhì)譜條件：轟擊源：EI；電子能量：70 eV；倍增器電壓：350 V；接口溫度：250℃；離子源溫度：150℃；四級桿溫度：230℃；掃描范圍：35 amu～450 amu，AAP 質(zhì)譜庫檢索加以分析[15]。

1.2.10 黑木耳多糖的高碘酸氧化—Smith降解反應

取45.0 mg樣品，加入10 mL雙蒸水溶解，接著加入30 mmol/L NaIO412.5 mL，加入雙蒸水定容至25 mL，使得NaIO4終濃度為15 mmol/L，然后置于避光處反應，每隔6 h取樣0.1 mL，然后加入雙蒸水稀釋250倍，并以雙蒸水作為空白對照，于223 nm波長處測定吸光度，待吸光度值達到恒定時，加入乙二醇終止反應，高碘酸氧化反應完成，計算高碘酸的消耗量。

式中：c為樣品的濃度，g/mL；V為體積，mL。

取2 mL上述反應得到的高碘酸氧化液，加入1滴溴甲酚（紅）紫作為指示劑，加入0.006 mol/L的NaOH（鄰苯二甲酸氫鉀標定）進行滴定，計算反應中的甲酸生成量。

式中：c為樣品的濃度，g/mL；V為體積，mL。

將乙二醇處理后的反應液進行透析，分別通過流動水和蒸餾水透析24 h。然后將袋內(nèi)溶液進行減壓濃縮，接著加入NaBH4進行還原過夜。然后加入50%甲酸將pH值調(diào)整至6～7之間，通過流動水與蒸餾水各進行透析24 h。將其中的1/3部分（Ⅰ）干燥后用于氣質(zhì)聯(lián)用色譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）GC-MS分析，剩余部分進行Smith降解。通過加入同樣體積的1 mol/L H2SO4，將混合液于25℃水解40 h，通過BaCO3溶液將pH值調(diào)整至6左右。過濾溶液，將濾液置于蒸餾水中進行透析48 h，將透析液的袋外部分（Ⅱ）進行干燥，然后進行GC-MS分析，透析液的袋內(nèi)部分通過乙醇進行醇沉，接著離心分別得到上清部分（Ⅲ）和沉淀部分（Ⅳ），將上述樣品進行干燥后，分別進行GC-MS[15]。

1.2.11 黑木耳多糖的甲基化分析

將多糖樣品20 mg溶于10 mL水中，然后加入N-環(huán)已基-3-（2-嗎林代已基）碳二亞胺對甲苯黃酸鹽（C.M.C）300 mg，然后滴加 0.01 mol/L HCl，將 pH 值調(diào)整為4.75，維持2 h。接著加入2 mmol/L硼氫化鈉溶液（20 mL），用4 mol/L HCl調(diào)整pH值為7.00，持續(xù)攪拌。NaBH4加完后，室溫下繼續(xù)反應l h，用蒸餾水對反應液進行透析，將透析內(nèi)液減壓濃縮至10 mL，冷凍干燥。上述還原反應通常進行2次～3次，取少量樣品進行完全水解進行薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）分析，以確定還原是否完全[16-17]。

①多糖溶解：稱取約20 mg AAP樣品，溶于6 mL DMSO中，充N2后立即用封口膜封管，室溫磁力攪拌過夜，至充分溶解。

②NaOH-DMSO混懸液的制備：將240 mg完全干燥的NaOH與6 mL DMSO混合，充N2后立即用封口膜封管，25℃磁力攪拌，過夜，使其充分混勻。

③甲基化：將6 mL NaOH-DMSO混合液加入已充分溶解的糖樣中，充N2，封管，磁力攪拌1 h，冰浴5 min，待反應液體完全冷凍后，冰水浴條件下緩慢滴加3.6 mL碘甲烷，密封，磁力攪拌，反應液逐漸解凍，澄清，直至成為亮黃色溶液?；謴椭潦覝兀^續(xù)攪拌30 min，完畢，加水中止反應，減壓除去碘甲烷（＜30℃），自來水和蒸餾水分別透析24 h。透析內(nèi)液冷凍干燥。重復上述過程3次～4次。

④萃取甲基化多糖：將上述反應液濃縮至10 mL左右，加入等體積氯仿，充分振蕩30 min萃取甲基化多糖，收集下層的氯仿層，重復3次，合并萃取液。蒸餾水洗滌萃取液3次，接著加無水Na2SO4至沒過液面，干燥24 h。過濾，減壓濃縮氯仿至1 mL左右。取適量做紅外光譜檢查。

⑤紅外光譜（infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）檢查：如圖譜在3 400 cm-1處無吸收峰，則證明多糖甲基化完全。

⑥水解：完全甲基化的多糖真空干燥后，加90%甲酸2 mL，充N2封管，100℃水解6 h，然后加甲醇去除甲酸，至pH值為6～7，真空干燥，再加入2 mol/L三氟乙酸3 mL，密封，110℃水解2 h，然后用甲醇趕除三氟乙酸至中性，水解后的產(chǎn)物用2.0 mL水溶解。

⑦還原：加入NaBH460 mg還原3 h，室溫磁力攪拌；然后加入兩滴醋酸分解過量的硼氫化鈉至無氣泡產(chǎn)生。溶液減壓濃縮至干，加入甲醇蒸除硼酸，真空干燥。

⑧乙酰化：加乙酸酐2 mL，封管，100℃乙?；? h，減壓蒸干以除去多余的醋酸酐，然后加入1 mL氯仿萃取，反復3次。萃取液再減壓蒸干，無水Na2SO4干燥24 h，過濾。

⑨樣品分析：產(chǎn)物干燥后，用少許氯仿溶解，進行GC-MS分析。

GC-MS分析條件：采用Agilent7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備DB-17毛細管柱，60 m×0.25 mm×0.25 μm，程序升溫，柱溫 90℃，保持 1 min，以5℃/min至200℃，以2℃/min至210℃，以10℃/min至270℃，保持1 min，氦氣作載氣，進樣口溫度270℃，分流比 1∶1，柱流速 1.0 mL/min，EI（70 eV），接口溫度230℃，離子源溫度 200℃，掃描范圍：m/z 43～500，掃描速率：2.5 scan/s[17]。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS16.0軟件通過單因素方差分析和Duncan's多重比較法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，p＜0.05為差異性顯著，p＜0.01為差異性極顯著。所有的數(shù)據(jù)以平均值±標準差進行表達，通過Origin 9.0對數(shù)據(jù)進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳多糖的提取及乙醇分級沉淀

分別通過乙醇分級、DEAE-52離子交換柱和Sephadex G-100對黑木耳多糖進行梯度洗脫，其中DEAE-52離子交換柱、Sephadex G-100和高效液相色譜的洗脫曲線分別見圖 1（A）、（B）和（C）。結(jié)果均顯示該多糖為單一峰，其他梯度沒有洗脫峰，同時通過高效液相色譜儀測定發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)單一對稱峰，表明該多糖為均一多糖。通過減壓濃縮冷凍干燥得到多糖凍干粉。

2.2 黑木耳多糖的特性黏度與黏均分子量

利用烏氏黏度計通過梯度稀釋法對得到的黑木耳多糖特性黏度進行分析。根據(jù)Huggins方程，通過計算[ηspecificviscosity/c]的數(shù)值對濃度c作圖得到特性黏度為4.4 dL/g；通過公式[η]=kMa（式中：k為哈金斯常數(shù)；Ma為黏均分子量），由特性黏度推算得到AAP的黏均分子量為4.50×103Da。

圖1 黑木耳多糖離子交換柱（A）、葡聚糖凝膠柱洗脫曲線（B）和高效液相色譜圖（C）Fig.1 Elution cure of AAP on DEAE-cellulose ion exchange colum（A），Sephadex G-100（B）and HPLC（C）

2.3 黑木耳多糖的紅外譜圖分析

紅外光譜屬于分子吸收光譜，通過將頻率連續(xù)變化的紅外光照射到樣品上，一些特定波長的紅外射線被吸收，從而形成該樣品的紅外吸收光譜。由于化合物組成和結(jié)構(gòu)的不同，因此每一個化合物分子就具有獨特的紅外吸收光譜。因此可以通過紅外光譜對未知化合物的結(jié)構(gòu)進行初步分析和鑒定。

黑木耳多糖進行紅外譜圖見圖2，具體特征峰和官能團數(shù)據(jù)見表1。由圖2中可以看出，得到的黑木耳多糖的FT-IR光譜具有明顯的多糖特征吸收峰。在FTIR光譜中（表1），黑木耳多糖片段的特征性吸收峰均主要包括 3 429 cm-1、2 938 cm-1、1 614 cm-1、1 424 cm-1、1 145 cm-1、1 096 cm-1、821 cm-1和 819 cm-1。3 500 cm-1～3 300 cm-1處出現(xiàn)了一寬峰，是O-H伸縮振動吸收峰，說明存在分子間和分子內(nèi)氫鍵，其中3 429 cm-1處振動峰對應于O-H伸縮振動；在3 000 cm-1～2800 cm-1之間的2 938 cm-1處振動峰則對應于C-H伸縮振動。

1 606 cm-1～1 618 cm-1之間的 1 614 cm-1處振動峰（C=O非對稱伸縮振動）、1 424 cm-1處振動峰（C=O對稱伸縮振動）是糖醛酸中質(zhì)子化羧基特征峰。1145cm-1，1 091 cm-1～1 096 cm-1也是糖醛酸的特征峰。多糖在821 cm-1處有吸收，顯示α-糖苷鍵的存在。

圖2 黑木耳多糖的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectrum of AAP

表1 AAP的紅外光譜特征峰Table 1 FT-IR characteristic peak of AAP

2.4 黑木耳多糖單糖組成比例分析

單糖組成與分子量構(gòu)成了多糖的一級結(jié)構(gòu)，其與多糖的生物活性密切相關(guān)，通過將多糖樣品酸完全水解成單糖，進而通過GC-MS依據(jù)單糖標準品保留時間分析多糖鏈的單糖組成。黑木耳多糖單糖組成比例見表2。

表2 AAP的單糖組成Table 2 The percent of monosaccharide of AAP %

如表2，可以看出由鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成AAP，其中半乳糖為主要單糖，占63.2%，其次是葡萄糖和半乳糖醛酸，分別占17.1%和10.4%，然后是D-甘露糖占3.1%，所占比例最低的為L-鼠李糖和D-木糖，各占0.3%。

2.5 黑木耳多糖的高碘酸氧化—Smith降解分析

高碘酸氧化作為一種選擇性氧化反應，其只作用于多糖分子中連二羥基或連三羥基。其中前者中的碳-碳鍵能夠被氧化斷開形成相應的醛，而后者中的碳-碳鍵則被氧化斷開后生成甲酸和對應的醛，因此可通過高碘酸消耗量和甲酸生成量對糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度與支鏈多糖的分支數(shù)量進行分析。而Smith降解主要針對被高碘酸破壞的糖苷鍵進行斷裂，而未被高碘酸氧化的糖殘基仍然連接在糖鏈上，從而通過對降解產(chǎn)物進行分析來推測多糖糖苷鍵的鍵型和所在位置。

高碘酸氧化反應結(jié)果見表3，AAP氧化過程中出現(xiàn)了甲酸，表明AAP中存在1→或1→6鍵型，高碘酸的消耗量多于甲酸的生成量的2倍，表明多糖中還存在其他連接方式，如1→2、1→2，6、或1→4鍵型或1→4，6鍵型等。多糖中平均每摩爾己糖殘基釋放0.67mol/L的甲酸，說明每10個己糖殘基平均有6.71個非還原末端或者1→6糖苷鍵。

表3 AAP的高碘酸氧化結(jié)果Table 3 The result perriodate oxidation of AAP

通過高碘酸氧化后進行完全酸水解，然后對經(jīng)乙?；@得的各衍生物進行GC-MS分析，分析結(jié)果見表4。結(jié)果表明通過高碘酸氧化后產(chǎn)物經(jīng)完全酸水解檢測出甘露糖，表明AAP中有不被高碘酸氧化的鍵型，如 1→3、1→3，4、1→3，6、1→2，4 鍵型等；而袋外部分和袋內(nèi)上清中檢測得到葡萄糖、甘露糖和木糖，說明其存在不被高碘酸氧化的鍵型且位于支鏈或靠近主鏈的支鏈上。袋內(nèi)沉淀存在葡萄糖、甘露糖和半乳糖，表明主鏈中的葡萄糖、甘露糖和半乳糖存在不被高碘酸氧化的 1→3、1→3，4、1→3，6、1→2，3、1→2，3，4等鍵型。

表4 AAP的Smith氧化降解產(chǎn)物氣質(zhì)分析結(jié)果Table 4 GC-MS analysis results of AAP fractions after Smith degradation

2.6 黑木耳多糖的甲基化分析

甲基化分析為糖鏈連接次序分析的一種重要手段，在多糖結(jié)構(gòu)化學及儀器分析方法中比較常用。其中把多糖中單糖殘基包含的游離羥基完全甲基化為甲基化機理，然后把多糖的糖苷鍵水解，水解后所得到的化合物中羥基的歸屬位置就是原多糖中單糖殘基的連接位點。可以通過計算甲基化單糖的比例，來推測連接鍵的類型在多糖結(jié)構(gòu)中所占的比例。

通過該方法獲得的羥基，還包括用NaBH4還原醛基而產(chǎn)生羥基，然后乙酰化來制備得到經(jīng)過甲基化反應的糖醇乙酸酯（該化學物質(zhì)容易揮發(fā)，因此需要通過GC進行分析），最后通過GC-MS分析，依照氣相色譜圖中峰的相對保留時間和質(zhì)譜譜圖的離子碎片結(jié)果可以準確地確定糖的連接鍵型[18]。

AAP的甲基化分析結(jié)果見表5和表6，由于鼠李糖、木糖和半乳糖醛酸的含量很低，在GC-MS分析過程中并沒有被檢測到，AAP中的葡萄糖以1→2、1→3、1→6鍵型存在；甘露糖以1→3、1→6鍵型存在；半乳糖以1→、1→6鍵型存在。由此確定了AAP中各個單糖的連接方式。綜合上述分析結(jié)果和文獻報道[16-17]，推測 AAP（V）中含有→6）-α-D-Galp-（1→、-Manp-（1→、→3，4）-α-D-Manp-（1→、→3）-α-D-Manp-（1→和→6）-α-D-Glcp-（1→等殘基。

表5 AAP的糖苷鍵分析結(jié)果Table 5 The result of glycosidic bonds analysis of AAP

表6 AAP的甲基化分析結(jié)果Table 6 The result of methylation analysis of AAP

3 結(jié)論與討論

多糖作為一類由單糖縮合而成的高分子聚合物，其分離純化方法主要有季銨鹽沉淀法、分級沉淀法、金屬鹽沉淀法、電滲析法、透析法、膜分離法和色譜分離法等，目前一般采用DEAE-纖維素或其他各種不同種類的凝膠柱層析以及離子交換色譜法。本文采用離子交換纖維素DEAE-52及葡聚糖凝膠層析Sephadex G-100分離得到一種黑木耳酸性多糖，采用烏氏黏度計法、高碘酸氧化、Smith降解和甲基化分析等化學分析方法和紫外、紅外、HPLC、GC-MS等儀器分析方法對其單糖組成和結(jié)構(gòu)進行初步鑒定，取得了較好的結(jié)果；以往科研人員大多從黑木耳中提取得到的多糖其相對分子質(zhì)量較大，而本試驗從黑木耳子實體中得到的AAP相對分子質(zhì)量為4.50×103Da，因此為黑木耳多糖的研究與開發(fā)利用提供了一定基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

本文采用水提醇沉法、Sevage法脫蛋白，從黑木耳中提取黑木耳多糖。通過乙醇分級、離子交換纖維素DEAE-52及葡聚糖凝膠層析Sephadex G-100對AAP進行純化，發(fā)現(xiàn)AAP為一種具有高分支結(jié)構(gòu)的葡聚糖，通過烏氏黏度計法測定黏度，并通過公式[η]=kMa計算得到AAP的黏均分子量為4.50×103Da，采用紅外光譜（FT-IR）、高效液相色譜（HPLC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）對其主要組分的理化性質(zhì)和化學結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明其所含鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖的百分比為 0.3∶17.1∶0.3∶3.1∶63.2，通過進一步對AAP甲基化分析，并對其糖殘基的連接方式進行分析，AAP 中含有→6）-α-D-Galp-（1→、-Manp-（1→、→3，4）-α-D-Manp-（1→、→3）-α-D-Manp-（1→和→6）-α-D-Glcp-（1→等殘基。