非小細胞肺癌化療敏感性與EML4-ALK、EGFR、KRAS、c-MET基因狀態(tài)的關系

黃暉，李麗華，萬敏娜，萬琳，鄒懷宇，萬潔華

（宜春市人民醫(yī)院 全科醫(yī)學科，江西 宜春 336000）

肺癌是中國最常見的惡性腫瘤之一[1]，我國女性非吸煙患者中以腺癌為主，吸煙患者則多見鱗狀細胞癌?；熓沟弥型砥诜切〖毎伟┗颊呤芤?，能延長患者的疾病無進展時間和總生存時間。近年培美曲塞單藥或聯(lián)合鉑類成為肺腺癌的一線治療；紫杉醇類或吉西他濱聯(lián)合鉑類用于肺鱗癌的一線治療。但有效率不容樂觀，化療的總有效率不足35%。如何預判患者的化療反應成為臨床研究的熱點?；驒z測揭示癌細胞的基因特點。最早引起關注的是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變，該突變使得癌細胞加速增殖、分化和侵襲，而該基因改變在亞洲非吸煙女性的肺腺癌患者中更易被發(fā)現(xiàn)[2]。針對突變患者，使用EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI）治療，較傳統(tǒng)治療比較，患者的無病生存期和總生存期均延長[3-5]。隨著研究的進展，人們發(fā)現(xiàn)EGFR-TKI的耐藥基因和新的靶點，比如間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）基因突變預示著EGFR-TKI治療效果差[6]，KRAS基因（K-ras,p21）和c-MET靶點有潛在的治療價值等[7-8]。但是靶向治療雖然在晚期腫瘤患者中研究眾多，且多數(shù)研究結(jié)果顯示患者受益，靶向治療如何與傳統(tǒng)治療包括化療、放療等治療方法協(xié)同，靶點基因改變是否與傳統(tǒng)治療效果存在相關性等問題仍未明確。循環(huán)腫瘤 DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）主要是由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，以DNA蛋白質(zhì)復合物或游離DNA兩種形式存在。ctDNA來自腫瘤細胞基因組突變，檢測準確性高、很少出現(xiàn)假陽性。ctDNA是一種特征性的腫瘤生物標志物，來自腫瘤細胞的體細胞突變[9-12]，不同于遺傳突變的是其存在于體內(nèi)每個細胞。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015年1月—2018年1月在江西省宜春市人民醫(yī)院就診的肺癌患者，經(jīng)活檢證實為非小細胞肺癌，參照CT、MRI、B超等檢查結(jié)果明確局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，參照第8版肺癌TNM分期，入組Ⅲ期b至Ⅳ期患者96例?；颊呓邮芑熤辽?個周期后評判治療效果，化療方案為：腺癌采用培美曲塞+順鉑；鱗狀細胞癌采用紫杉醇+順鉑。參照實體瘤的療效評價標準（RECIST 1.1）[13]，將效果分為：①完全緩解，指靶病灶消失，病理淋巴結(jié)直徑小于1 mm，持續(xù)＞4周；②部分緩解，指病灶直徑之和減少超過30%，持續(xù)＞4周；③疾病進展，指病灶直徑之和超過20%；④疾病穩(wěn)定，指未達到部分緩解，也未達到疾病進展的程度。參照WHO化療毒副作用分級，將化療副作用分成5級[14]。參照Karnofsky功能狀態(tài)評分標準（KPS評分）評價患者體力狀況。

本實驗患者平均（64.25±12.46）歲；男∶女為15∶33；患者有吸煙史22例；腺癌64例，鱗狀細胞癌32例；Ⅲb期患者42例，Ⅲc期患者38例，Ⅳ期患者16例；治療前Karnofsky評分均小于60分患者。

1.2 研究方法

1.2.1 收集樣本 血液標本均在患者接受治療前保留。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批同意，所有患者在保留血液標本和檢測ctDNA前均簽署知情同意書。

1.2.2 血清收集、ctDNA 擴增和基因突變分析 患者于治療開始前1天清晨收集10 ml靜脈血，置于含有 EDTA 的標本管內(nèi)，于收集2 h內(nèi)4℃，3 000 r/min離心10 min；血漿在監(jiān)測分析前置入-80℃冰箱冷凍保存。采用擴增受阻突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）血漿EGFR、ALK、KRAS、c-MET基因突變分析方法，對外周血測ctDNA中目標基因狀況進行檢測。外周血腫瘤細胞游離DNA的提取方法按照廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司血漿標本DNA提取試劑盒說明書進行操作。ARMS實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）擴增采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司目的基因檢測試劑盒，按照試劑和操作步驟和要求對目的基因突變狀態(tài)進行監(jiān)測分析。

1.2.3 化療方案 腺癌患者 64 例均接受培美曲塞（500 mg/m2，第 1 天）+ 順鉑（75 mg/m2，第 1 天）化療方案化療，16例患者接受化療2周期后手術(shù)，48例患者接受4周期化療后接受評價；鱗狀細胞癌患者32例均接受紫杉醇（175～200 mg/m2，第1天）+順鉑（75 mg/m2，第1天）方案化療，6例患者接受2周期化療后手術(shù)，10例患者接受3周期化療后手術(shù)或更改治療方案，16例患者接受4周期化療后評價。其中接受手術(shù)在手術(shù)結(jié)束1周后進行評估。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2 結(jié)果

2.1 血清基因變化、化療效果及化療副作用情況

EGFR基因突變包括EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)18、19、20、21外顯子的突變?yōu)辄c，共檢測50例突變患者，檢測率為52.08%。其中18外顯子突變者8例，19外顯子缺失突變者24例，21外顯子突變者26例；其中6例合并有19外顯子缺失突變，2例合并18外顯子突變。AML4-ALK基因融合突變者4例，檢測率為4.17%。KRAS基因突變者8例，檢出率為8.33%。c-MET基因突變者16例，檢測率為16.67%。本試驗化療總有效率為29.17%（28例/96例），其中腺癌患者總有效率為31.25（20例/64例）；鱗狀細胞癌患者總有效率為25.00%（8例/32例）。消化道副作用包括惡心、嘔吐、腹瀉、便秘等48例，嚴重消化道反應需補液治療者10例；骨髓抑制60例，嚴重骨髓抑制、需集落刺激因子注射治療的8例；不同程度脫發(fā)者30例，嚴重者4例；其他未見明顯毒副反應。見表1。

表1 患者的化療效果情況

2.2 不同EGFR基因狀態(tài)患者的化療效果及化療副作用情況

50例EGFR突變患者中包括48例肺腺癌患者和2例肺鱗癌患者，化療有效12例，有效率為24.00%；46例EGFR野生型患者中包括16例肺腺癌患者和30例肺鱗癌患者，化療有效21例，有效率為45.65%。兩組化療有效率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組化療嚴重化療毒副作用的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 不同ALK基因狀態(tài)患者的化療效果及化療副作用情況

5例ALK突變者中有4例為棘皮動物微管相關蛋白樣4與間變淋巴瘤激酶融合基因（echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK）融合突變患者，他們均為肺腺癌患者，這4例化療均有效，有效率100%；92例無AML4-ALK融合突變患者中包括60例肺腺癌患者和32例肺鱗癌患者，化療有效28例，有效率30.77%。兩組化療有效率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組化療嚴重化療毒副作用的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 不同KRAS基因狀態(tài)患者的化療效果及化療副作用情況

8例KRAS突變患者均為肺腺癌患者，化療總有效例數(shù)為6例，有效率75%（6例/8例）；88例KRAS無突變患者中包括56例肺腺癌患者和32例肺鱗癌患者，化療總有效例數(shù)為27例，有效率30.68%。兩組化療有效率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組化療嚴重化療毒副作用的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表2 不同EGFR基因狀態(tài)患者的化療效果及化療副作用情況 例（%）

表3 不同ALK基因狀態(tài)患者的化療效果及化療副作用情況 例（%）

2.5 不同c-MET基因狀態(tài)患者的化療效果及化療副作用情況

16例c-MET突變患者中包括14例肺腺癌患者和2例肺鱗癌患者，化療有效為2例，有效率12.50%（2/16）；80例c-MET無突變患者中包括50例肺腺癌患者和30例肺鱗癌患者，化療有效為31例，有效率38.75%。兩組化療有效率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組化療嚴重化療毒副作用的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5。

表4 不同KRAS基因狀態(tài)患者的化療效果及化療副作用情況 例（%）

表5 不同c-MET基因狀態(tài)患者的化療效果及化療副作用情況 例（%）

3 討論

最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國每年有約28萬例新確診的肺癌患者，其中很大部分為晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）[1]。針對晚期NSCLC治療手段多選擇含鉑類藥物的化療，但化療只有約20%的反應率和8～10個月的中位生存期。雖然研究眾多，但是如何在治療之前判斷化療受益的患者仍然是個難題。

分子遺傳學研究進展讓人們認識并嘗試識別導致NSCLC的關鍵基因突變，也因此誕生了各種特異性的分子靶向藥物。肺癌的組織亞型不同，治療的方法也不同。非鱗狀NSCLC患者使用培美曲塞+鉑類效果優(yōu)于吉西他濱+鉑類。以肺腺癌為例，可以根據(jù)相關驅(qū)動基因突變進一步細分成亞群。常見的肺腺癌驅(qū)動基因包括EGFR、KRAS、人類表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）及MET基因突變和ALK等基因重排。驅(qū)動基因的表達存在組織學差異，相比腺癌，鱗狀細胞癌中，EGFR基因突變非常罕見，多見成纖維細胞生長因子受體1的基因擴增，盤狀結(jié)構(gòu)域受體2基因突變和PI3KCA基因的擴增和突變。

在NSCLC的研究中，EGFR一直是一個熱點?；仡櫺匝芯匡@示[15]，亞裔女性的腺癌患者、既往少量/無吸煙史，EFGR突變率可達60%，使用EGFR TKI治療的敏感率也高。18～21號外顯子突變可編碼出大量EGFR酪氨酸激酶，對初發(fā)的敏感性EGFR突變的NSCLC患者，應用TKI治療在客觀反應率（objective response rate,ORR）、無進展生存期（progression-free survival,PFS）和生活質(zhì)量均優(yōu)于化療。因此，晚期NSCLC患者常規(guī)進行EGFR基因檢測，可根據(jù)突變情況選擇是否行EGFR TKI一線治療。但隨著臨床觀察的積累，人們發(fā)現(xiàn)，所有接受TKI治療的患者最終會出現(xiàn)耐藥，并導致腫瘤進展和死亡[16]。靶向治療的進展開始圍繞著解決耐藥和尋找新的靶點展開。

EML4與ALK是分別位于人類2號染色體的p21和p23上的基因片段[6]。EML4與ALK是新發(fā)現(xiàn)的肺腺癌驅(qū)動基因。這2個基因片段的倒位融合能夠使得組織表達新的融合蛋白EML4與ALK，這種融合基因能通過PI3K-AKT，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）和 JAK-STAT 途徑導致腫瘤的發(fā)生。這種突變僅占非小細胞肺癌的4%～7%。它更容易出現(xiàn)在既往少量/無吸煙史和年輕的腺癌患者身上。ALK抑制劑在臨床Ⅲ期研究中[17]，與化療比較，對晚期NSCLC患者更受益，其可達56%。

MET是一種絡氨酸激酶受體，它的過度激活與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預后與轉(zhuǎn)歸密切相關[7]。大約7%的NSCLC患者可出現(xiàn)MET的過表達。在一項克唑替尼治療晚期非小細胞肺癌的研究表明，克唑替尼治療MET高度過表達的患者，反應率可高達67%[18]。

KRAS是RAS家族的一員。KRAS基因突變能持續(xù)刺激細胞生長，阻止細胞死亡，從而導致腫瘤的發(fā)生。伴有KRAS基因突變的NSCLC患者會有更高的復發(fā)和轉(zhuǎn)移概率。研究顯示KRAS突變的概率在NSCLC患者為15%～25%，腺癌、吸煙史及白色人種是KRAS突變的危險因素[8]。雖然目前并未治療KRAS基因突變的晚期非小細胞肺癌藥物，但是人們研究重點集中在KRAS的下游通路上，如MEK。在一項臨床研究中，口服的MEK抑制劑司美替尼（selumetinib）聯(lián)合化療用于經(jīng)治的KRAS突變非小細胞肺癌患者。與單純化療比較，其（37%∶0%）、PFS（5.3個月∶2.1個月）、OS（9.4個月∶5.2個月）均有長足的進步[19]。

化療可以干擾腫瘤驅(qū)動基因的表達狀態(tài)，因此，在治療過程中，應用靶向治療與化療的先后順序如何確定成需要迫切解決的問題，以便使患者受益最大化。本研究顯示，EGFR野生型患者化療的反應性好于EGFR突變患者，腫瘤縮小的患者比例較多，雖然有許多報道顯示化療反應率在兩組患者無差異，但患者的疾病無進展生存差異明顯，說明EGFR突變與否影響化療反應。筆者的數(shù)據(jù)進一步印證該現(xiàn)象，而筆者分析兩組患者中出現(xiàn)嚴重化療毒副作用的差異，統(tǒng)計顯示，兩組間為體現(xiàn)有差異，說明EGFR基因狀態(tài)未影響機體對化療的耐受能力。

從數(shù)據(jù)顯示，EML4-ALK、KRAS、MET等基因的狀態(tài)均影響患者的化療效果。研究顯示，KRAS的血清水平與胰腺癌的預后呈負相關[20]，其機制和KRAS影響化療反應相關，該結(jié)果似乎與筆者的數(shù)據(jù)不符，其原因可能是以KRAS基因狀態(tài)為因素分組的例數(shù)過少導致結(jié)果出現(xiàn)的偏差，KRAS基因狀態(tài)能否影響NSCLC的化療反應有待進一步研究。同樣的情況在本研究中也出現(xiàn)EML4-ALK組和MET組。

有意思的是，EML4-ALK、KRAS、MET等基因狀態(tài)不同，其出現(xiàn)嚴重的化療副作用的概率也不同，雖然因為例數(shù)過少可能導致數(shù)據(jù)偏移，但這仍需引起關注。分析NSCLC患者的血清基因狀態(tài)與化療反應的關系，有利于發(fā)現(xiàn)化療受益的優(yōu)勢人群，以便患者最大受益。