高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)復(fù)方紫草油微乳主藥成分含量的研究*

梅志輝，許敏，雷群芳，曾嶸

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 藥學(xué)部，湖南 長沙 410008）

復(fù)方紫草油是一種由紫草、黃芩、白芷等5種中藥組成的治療燒燙傷、瘡瘍及放射性皮膚損傷的外用復(fù)方制劑[1]，具有抗菌抗炎、清除活性氧自由基、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、血管生成等功效[2-5]。君藥紫草中含有萘醌類總色素、紫草多糖等化學(xué)成分[6]，紫草萘醌和白芷中香豆素類成分極性小，不溶于水，易溶于油。而黃芩的黃酮類有效成分和甘草的甘草酸類有效成分極性大，難溶于植物油[7]。采用麻油作為提取溶劑的傳統(tǒng)方法很難將所有有效成分提取出來，因而需尋求一種新的溶劑來同時(shí)溶解復(fù)方中藥制劑中的不同極性成分。微乳對(duì)水溶性和脂溶性成分都具有很好的溶解的作用，其作為外用藥物載體可增加難溶性成分溶解度，增大皮膚擴(kuò)散速率[8]，提高藥物的生物利用度[9-10]。本研究通過對(duì)復(fù)方紫草油進(jìn)行劑型改造，采用一步法制備得到的復(fù)方紫草油微乳外觀澄清透明、穩(wěn)定性好，在抗氧化作用、保濕作用及激活酪氨酸酶方面的實(shí)驗(yàn)中均取得較好的效果。為建立制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究建立一種高效液相色譜方法同時(shí)測(cè)定復(fù)方紫草油微乳中3種有效成分黃芩苷、歐前胡素及紫草素的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1100液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），AG285型電子分析天平（瑞士Mettler公司），TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)、KS-600超聲儀（上海易凈超聲波儀器有限公司）。

1.2 試劑

對(duì)照品黃芩苷（批號(hào)：MUST-16022813，中國藥品生物制品檢定所），歐前胡素（批號(hào)：14031710，中國藥品生物制品檢定所），左旋紫草素（批號(hào)：MUST-16041419,中國藥品生物制品檢定所），乙腈，甲醇（色譜純），磷酸（分析純）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。水為重蒸餾水，復(fù)方紫草油微乳（自制）。

1.3 色譜條件

色譜柱：DiamonsilTMC18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～ 12 min，30% B；12～ 30 min，30% ～54% B ；30～ 45 min，54% B ；45～ 60 min，54% ～85% B）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：30℃ ；進(jìn)樣量 ：20 μl。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品混合溶液 取已知濃度 0.691 2 g/L 黃芩苷儲(chǔ)備液 5 ml、0.038 6 g/L 歐前胡素 1 ml、0.062 7 g/L紫草素2 ml于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品混合溶液。

1.4.2 供試品溶液精密量 取本品 5 ml，加 20 ml甲醇，振搖、定容至 25 ml，于 3 500 r/min 條件下離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，即得。

1.4.3 陰性對(duì)照溶液 按照復(fù)方紫草油微乳處方的比例，分別制備不含黃芩苷、歐前胡素和紫草素的陰性樣品，以及不含藥物的空白微乳，精密量取2 ml，按照色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。黃芩苷、歐前胡素及紫草素的保留時(shí)間分別約為9.3、39.1和41.5 min。陰性樣品色譜在與樣品中黃芩苷、歐前胡素及紫草素相應(yīng)的保留時(shí)間處無吸收峰。

1.5 方法學(xué)試驗(yàn)

1.5.1 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品混合溶液、陰性對(duì)照品、供試品溶液各20 μl，按照色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。

1.5.2 線性試驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品 6、12、24、30、36和48 μl，按照色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)峰面積，并以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)樣回歸，得黃芩苷、歐前胡素及紫草素的回歸方程。

1.5.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品混合溶液，按照色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算黃芩苷、歐前胡素及紫草素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 同種方法制備復(fù)方紫草油微乳樣品6份，分別制備供試品溶液，按照色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算黃芩苷、歐前胡素及紫草素的含量平均值和RSD值。

1.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液 3 份，分別于0、4、6、8、12和24 h，按照色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)1次，檢測(cè)黃芩苷、歐前胡素及紫草素峰的面積和RSD值。

1.5.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品 6 份，每份0.5 ml，分別加入黃芩苷對(duì)照品溶液 1.0 ml，歐前胡素對(duì)照品溶液0.3 ml及紫草素對(duì)照品溶液0.4 ml，制成供試溶液，按色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算回收率。

1.5.7 樣品含量檢測(cè) 取 3 份同樣樣品適量，制備供試品溶液并進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算樣品中的黃芩苷、歐前胡素及紫草素的含量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察

按照色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。黃芩苷、歐前胡素及紫草素的保留時(shí)間分別約為9.3、39.1和41.5 min。陰性樣品色譜在與樣品中黃芩苷、歐前胡素及紫草素相應(yīng)的保留時(shí)間處無吸收峰。見附圖。

2.2 線性試驗(yàn)結(jié)果

線性試驗(yàn)得黃芩苷、歐前胡素及紫草素的回歸方程見表1。黃芩苷進(jìn)樣量在2.073～16.589μg、歐前胡素進(jìn)樣量在0.023～0.185μg、紫草素進(jìn)樣量在0.081～0.645μg之間呈良好的線性關(guān)系。

附圖 HPLC色譜圖

2.3 精密度

黃芩苷、歐前胡素及紫草素峰面積的RSD分別為0.92%、1.12%和0.79%。結(jié)果表明方法的精密度良好。

表1 3種成分的線性關(guān)系

2.4 重復(fù)性

計(jì)算黃芩苷含量平均值為 1954.68mg/ml，RSD為1.98 %；歐前胡素含量平均值為18.75mg/ml，RSD為 1.44 %；紫草素含量平均值為 53.67mg/ml，RSD為0.78%。

2.5 穩(wěn)定性

24h內(nèi)黃芩苷、歐前胡素及紫草素峰面積的RSD分別為1.21%、1.50%和1.50%，表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率比較

黃芩苷、歐前胡素及紫草素平均回收率分別為95.79%、99.04%和97.32%，RSD分別為3.23%、3.07%和2.71%，表明該方法回收率良好。見表2。

表2 紫草油微乳中3種成分的回收率 （n=6）

續(xù)表2

2.7 樣品含量

3份樣品含量檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 紫草油微乳中3種成分的含量測(cè)定結(jié)果 （μg/ml）

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道[11-13]用高效液色譜法檢測(cè)黃芩苷、歐前胡素及紫草素的含量，方法準(zhǔn)確可靠，但不能同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。本研究中發(fā)現(xiàn)黃芩苷在280nm波長處有最大吸收，歐前胡素在254nm波長處有最大吸收，紫草素在516nm波長處有較大吸收，但紫草油微乳中歐前胡素含量低，且黃芩苷在254nm波長處也有較強(qiáng)吸收，綜合考慮選擇254nm波長處為檢測(cè)波長。當(dāng)用甲醇作為流動(dòng)性時(shí)，歐前胡素與紫草素峰有干擾，以水作為流動(dòng)相時(shí)黃芩苷解離并未出峰，在酸性條件下黃芩苷解離受到抑制，且對(duì)歐前胡素、紫草素的成分檢測(cè)無影響。最后優(yōu)選出乙腈-0.1%磷酸溶液可使處方中3個(gè)成分的分離效果和峰形較理想。通過試驗(yàn)不同溫度25、30和35℃，優(yōu)選出柱溫為30℃。上述方法學(xué)研究的系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，建立的高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)黃芩苷、歐前胡素及紫草素有效成分的含量，其待測(cè)溶液穩(wěn)定、精密度高、線性關(guān)系良好、回收率符合檢測(cè)方法的要求，不但節(jié)省了分離時(shí)間，還能夠準(zhǔn)確檢測(cè)各個(gè)成分的含量，是一種較理想的含量檢測(cè)方法，可用于制劑質(zhì)量控制。