RhoA蛋白及驅(qū)動蛋白KIF2A與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性研究

管文華，項鋒鋼

（青島大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 病理學系，山東 青島 266021）

卵巢癌是婦科常見的一種惡性腫瘤，卵巢癌的5年生存率較低，約在25%～30%[1]，卵巢癌具有高的增殖及轉(zhuǎn)移潛力，但發(fā)病機制尚不完全清楚。研究卵巢癌的惡性生物學行為機制，尋找新的治療靶點，已經(jīng)成為亟待解決的問題。

有研究提示，驅(qū)動蛋白KIF2A的表達與多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。Rho家族蛋白是Ras超家族中的一類小分子G蛋白，具有GTP酶活性，在細胞信號傳導中起著重要作用，與腫瘤新生血管生成、細胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤侵襲以及腫瘤生長增殖等有著十分密切的關(guān)聯(lián)。相關(guān)研究報道中明確提出，RhoA在許多腫瘤中表達增加[3]。但KIF2A和RhoA在卵巢癌中的研究尚少見報道。另外，同是促癌基因，兩者在卵巢癌中的表達有無相關(guān)性，兩者間是否存在調(diào)控關(guān)系，兩者可否作為卵巢癌靶向治療的新靶點，這些問題目前均無準確答案。

本研究通過檢測RhoA和KIF2A蛋白在正常卵巢、卵巢上皮良性腫瘤及卵巢癌組織中的表達情況，了解RhoA和KIF2A蛋白與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系及兩者間的相關(guān)性，為臨床治療卵巢癌提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6月—2016年6月青島大學附屬醫(yī)院手術(shù)切除的卵巢癌患者45例、卵巢上皮良性腫瘤患者25例及正常卵巢組織患者20例。年齡26～69歲，平均（48.7±10.07）歲。所有患者在切除卵巢組織標本前均未進行化療或放療，正常卵巢組織取自子宮病變同時切除正常卵巢者，所有患者經(jīng)手術(shù)后病理檢查確診。卵巢癌病理類型：漿液性21例，子宮內(nèi)膜樣15例，黏液性9例；病理分級：低分化16例，高中分化29例；FIGO分期為Ⅰ、Ⅱ期26例，Ⅲ、Ⅳ期19例；術(shù)中清掃淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移者15例。

1.2 試劑

KIF2A小鼠單克隆抗體、RhoA小鼠單克隆抗體均購自英國Abcam公司，置入-20℃冰箱冷凍保存，工作濃度均為1∶100，鏈霉菌抗生物素蛋白——過氧化酶（SP）法試劑盒、DAB（3，3，-diaminobenzidine 3，3，-二氨基聯(lián)苯胺）酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學染色

10%中性甲醛對實驗標本予以固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，4 μm厚，每份標本留5張，其中1張進行HE染色，其余行免疫組織化學實驗。陽性對照物選取已知陽性組織切片，陰性對照物選取PBS代替一抗，采用SP法檢測，蠟塊切片經(jīng)過脫蠟、水化后，滴加3%過氧化氫H2O2孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）進行抗原修復，切片上滴加封閉用正常山羊血清液（室溫下孵育20 min）。滴加一抗，4℃過夜，PBS洗滌，對生物素標記二抗（于37℃環(huán)境內(nèi)予以孵育，孵育時間30 min）予以滴加，滴加1滴；PBS洗滌后，對辣根酶標記鏈霉卵白索工作液（37℃環(huán)境內(nèi)予以孵育，孵育時間20 min）予以滴加，滴加1滴。PBS洗滌，對新鮮配制的DAB予以滴加顯色，顯色時間控制在6 min左右，于顯微鏡視野下觀察染色程度，充分水洗；水洗完成后選取蘇木精復染，二甲苯透明5 min，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片，于顯微鏡視野下觀察。

1.4 免疫組織化學結(jié)果的判定

染色細胞漿中對KIF2A和RhoA予以染色處理，呈淺黃色—棕黃色，彌漫分布。判定主要依據(jù)陽性細胞百分比與染色強度[4]，每張切片對典型腫瘤細胞視野予以隨機選取，共選取10個，每一個視野對100個腫瘤予以計數(shù)，并計算陽性細胞百分數(shù)。按照著色細胞陽性百分比予以評分：①4分為75%以上；②3分為51%～75%，彌散；③2分為26%～50%，局部；④1分為5%～25%，散發(fā)；⑤0分為5%以下，陰性。同時，按照染色強度予以評分，即：①強著色代表3分，中度著色代表2分，弱著色代表1分，不著色代表0分。將染色強度評分與著色細胞陽性百分比相乘，RhoA、KIF2A評分（0～12）分別對應4種表達強度，即：①強陽性（+++）：9～12分；②中度陽性（++）：5～8分；③弱陽性（+）：2～4分；④陰性（-）：0～1分。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用例（%）表示，兩獨立樣本采用Mann-WhitneyU檢驗，多個獨立樣本的比較采用Kruskal-WallisH檢驗，在有統(tǒng)計學意義的基礎(chǔ)上，兩兩比較采用Nemenyi法，采用Spearman做相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 正常卵巢、卵巢上皮良性腫瘤及卵巢癌組織中KIF2A、RhoA的表達

圖1 KIF2A在卵巢癌中的高表達 （SP×400）

圖2 RhoA在卵巢癌中的高表達 （SP×400）

KIF2A和RhoA主要定位于細胞漿中（見圖1、2），免疫組織化學染色呈淺黃色—棕黃色（+）～（+++）。KIF2A在正常卵巢組織和卵巢上皮良性腫瘤組織中的陽性率分別為15.0%（3/20）和20.0%（5/25），在卵巢癌組織中陽性率為77.8%（35/45），3組比較差異有統(tǒng)計學意義（H=40.834，P=0.000）；其中KIF2A在正常卵巢組織和卵巢上皮良性腫瘤組織中的陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（H=0.043，P=0.979）；與卵巢上皮良性腫瘤組織、正常卵巢組織比較，卵巢癌組織中KIF2A的陽性率更高（H=27.931和26.397，均P=0.000）。見表1。

RhoA在正常卵巢組織和卵巢上皮良性腫瘤組織中的陽性率分別為10.0%（2/20）和16.0%（4/25），卵巢癌組織中陽性率為62.0%（28/45），3組比較差異有統(tǒng)計學意義（H=27.513，P=0.000）；RhoA在卵巢正常組織和卵巢上皮良性腫瘤組織中的陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（H=0.090，P=0.960）；與卵巢上皮良性腫瘤組織、正常卵巢組織比較，卵巢癌組織中RhoA的陽性表達更高（H=18.190和18.440，均P=0.000）。見表1。

2.2 卵巢癌組織中KIF2A、RhoA的表達與臨床病理特征的關(guān)系

Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌KIF2A的表達較Ⅲ、Ⅳ期低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者KIF2A的表達較未轉(zhuǎn)移者高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而不同年齡、不同組織學分級及不同病理類型KIF2A的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

低分化卵巢癌較高分化者RhoA蛋白表達高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者RhoA蛋白較未轉(zhuǎn)移者表達高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而不同年齡、臨床分期及病理類型RhoA蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 卵巢癌組織中KIF2A、RhoA表達的相關(guān)性

Spearman等級相關(guān)性分析結(jié)果表明，KIF2A、RhoA在卵巢癌中的表達呈正相關(guān)（rs=0.801，P =0.000）。見表4。

表1 KIF2A、RhoA蛋白在正常卵巢、良性上皮卵巢腫瘤及卵巢癌組織中的表達

表2 KIF2A的表達與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表2

表3 RhoA的表達與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

表4 卵巢癌組織中KIF2A與RhoA表達的相關(guān)性 例

3 討論

卵巢癌具有腫瘤細胞過度增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的特點，預后較差。近年來人們開始關(guān)注和研究微管驅(qū)動蛋白與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，驅(qū)動蛋白在細胞有絲分裂中促進染色體移動的微管解聚過程中發(fā)揮重要作用[5]，其功能異?？赡芤鸹蚪M不均衡，造成子細胞中染色體異常，出現(xiàn)非整倍體、多倍體及腫瘤的發(fā)生[6-8]。KIF2A是驅(qū)動蛋白-13家族成員之一，具有催化解聚微管的作用，參與細胞有絲分裂，當KIF2A出現(xiàn)異常抑制或者異常激活狀況的時候，可對微管長度予以改變，導致中心染色體出現(xiàn)紊亂狀況，造成有絲分裂異常，最終對正常細胞增殖過程產(chǎn)生不良影響[9]。

本研究中，KIF2A在卵巢癌組織中表達增高，卵巢上皮良性腫瘤及正常卵巢組織中表達低，推測KIF2A異常高表達可能使微管發(fā)生動力學改變，微管解聚增強，加快促進細胞的分裂增殖，因此KIF2A可能參與卵巢癌細胞的增殖過程。另外本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中KIF2A的高表達出現(xiàn)在臨床分期晚及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中，推測可能因微管的減少和解聚與腫瘤周圍的局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)[10-12]，驅(qū)動蛋白KIF2A高表達可能使微管解聚增加，細胞骨架不穩(wěn)定，促進卵巢癌的局部浸潤和轉(zhuǎn)移過程。

近年來發(fā)現(xiàn)，RhoA蛋白與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在重要關(guān)系。Rho活性在人類腫瘤中經(jīng)常出現(xiàn)失調(diào)，可對腫瘤細胞浸潤、生長予以促進[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中RhoA高表達，而良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中為低表達，推測RhoA在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能通過對細胞骨架予以調(diào)節(jié)，對卵巢癌細胞增殖予以促進，使細胞間黏附作用下降，促進細胞外基質(zhì)降解，促進卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。另外本研究顯示，RhoA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中表達高，在組織學分化低的癌組織中表達高，提示RhoA可能通過破壞腫瘤細胞間的黏附作用，促進細胞外基質(zhì)降解，促進腫瘤血管形成參與了卵巢癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。這與SHEPELEV等[3]的研究結(jié)果相一致。

KIF2A和RhoA在卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中是否存在關(guān)聯(lián)機制尚不明確，尚無相關(guān)文獻報道。WANG等[15]在相關(guān)研究報道中明確提出，敲除KIF2A基因后，口腔鱗癌細胞內(nèi)MMP-9基因水平會明顯下降，KIF2A不僅能夠通過對細胞骨架予以改變，對細胞運動能力產(chǎn)生影響，還可能與MMP-9有相互作用，進一步增強突變細胞的遷徙、入侵基膜能力，在此基礎(chǔ)上對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲予以合理調(diào)控。而RhoA和RhoC則同屬于Rho亞家族成員，可影響基質(zhì)金屬蛋白酶活性。

本實驗結(jié)果表明，在卵巢組織中KIF2A和RhoA的表達呈正相關(guān)，且同是促癌基因，提示KIF2A和RhoA可能協(xié)同參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程。實驗結(jié)果可能受實驗樣本、方法、條件的限制。兩者間的關(guān)系需要更多的理論和數(shù)據(jù)支持。探討兩者在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的相互作用，有助于了解卵巢癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子生物學機制，為臨床靶向治療提供新的實驗依據(jù)。