6-姜辣素對黑色素瘤細胞增殖和凋亡的影響及機制研究

李利萍，賴勁東，黃艷，林新瑜

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 皮膚科，四川 瀘州 646000；2.遂寧市第一人民醫(yī)院 皮膚科，四川 遂寧 629000）

黑色素瘤是常見性皮膚惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)男性第5大惡性腫瘤，女性第6大惡性腫瘤，且近年來發(fā)病率逐年升高[1]。黑色素瘤早期癥狀隱匿導(dǎo)致其早期診斷率低，一旦確診多屬于晚期，導(dǎo)致黑色素瘤死亡率持續(xù)偏高[2]，目前黑色素瘤的治療主要以手術(shù)切除為主，輔助放療及化療[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)中藥在腫瘤治療中起到重要作用，如丹參、川芎或姜黃素等，研究中藥對黑色素瘤治療對提高腫瘤預(yù)后提供新的思路。

生姜在亞洲國家中被廣泛食用，6-姜辣素是生姜提取物中的主要活性成分，其在抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗炎等方面發(fā)揮重要功能[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)6-姜辣素通過促進前列腺癌[5]、腎癌[6]和宮頸癌[7]等細胞凋亡發(fā)揮抗癌效果，然而6-姜辣素對黑色素瘤增殖和凋亡的影響尚未報道。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的細胞器，各種生理或病理條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損會引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERs），長期過強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生[8]。本研究旨在探究6-姜辣素對黑色素瘤增殖和凋亡的影響，探究其是否通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮抗腫瘤功能的分子機制，為腫瘤治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人黑色素瘤細胞系M14和A375購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所，RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，6-姜辣素購自美國Sigma-Aldrich公司，Annexin V-FITC/碘化丙啶雙標記細胞凋亡檢測試劑盒購于廣州達博生物科技有限公司，半胱天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）/活化型半胱天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 [poly（ADP-ribose） polymerase,PARP]/活化型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[cleaved-poly（ADP-ribose）polymerase,Cleaved-PARP]抗體購自美國 CST 公司，免疫球蛋白結(jié)合蛋白（binding immunoglobulin protein,BIP）、肌醇激酶 1（inositol-requiring enzyme-1,IRE1）和氨基末端激酶（jun N-terminal kinase,JNK）抗體購自美國Abcam公司，β-actin抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及shRNA轉(zhuǎn)染

黑色素瘤細胞使用含10%胎牛血清RMPI 1640或DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)加入100 μg/ml青霉素（Sigma,USA）和鏈霉素（Sigma,USA），置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱，每隔2～3天對細胞進行換液，細胞貼壁達到80%時使用0.25%胰酶消化離心進行傳代。M14和A375細胞接種于6孔板中待細胞生長至60%～70%，轉(zhuǎn)染前用PBS清洗細胞，按轉(zhuǎn)染試劑說明書將無血清培養(yǎng)基、shRNA基因敲減質(zhì)粒或?qū)φ战MControl shRNA及轉(zhuǎn)染試劑混合靜置15 min后轉(zhuǎn)染M14細胞24或48 h，檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.3 甲基噻唑基四唑法檢測細胞增殖能力

取對數(shù)生長期的黑色素瘤細胞系M14和A375，按5 000個/孔接種于96孔板，細胞貼壁生長后加入不同濃度（0、10、20、40、60和80 μmol/L）6-姜辣素進行藥物處理，每種濃度藥物設(shè)5個復(fù)孔，重新放置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。吸去上清液加入含10%甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）的培養(yǎng)基 200μl繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO并置于微量振蕩器振蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處檢測吸光度（A）值，做出細胞生長曲線。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

M14和A375細胞接種于6孔板，調(diào)整細胞密度接種10×104個/孔培養(yǎng)至貼壁，加入60和40 μmol/L的6-姜辣素分別處理M14和A375細胞24 h，胰酶消化離心并收集細胞，使用800 r/min離心5 min并用PBS清洗2次，加入250 μl結(jié)合緩沖液并通過細胞計數(shù)獲得細胞濃度，并調(diào)整濃度為1×106個/ml，吸取100 μl調(diào)整濃度后細胞懸液加入5 ml流式管內(nèi)，分別加入 5 μl Annexin V-FITC（150 mg/L）和 10 μl碘化丙錠（120 mg/L）并充分混勻，放置于室溫條件下進行避光孵育15 min，孵育后的懸液中加入PBS清洗細胞，洗滌后的細胞使用流式細胞儀（FACS）分析細胞凋亡率。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達

M14和A375細胞常規(guī)培養(yǎng)，使用胰酶消化離心并傳代接種于6孔板中，待細胞貼壁生長至60%～70%時加入不同濃度6-姜辣素進行處理24 h，取出并用PBS清洗3遍，加入細胞裂解液提取蛋白，4℃、15 000 r/min 離心 15 min，取 5 μl上清液使用 BCA 法測定蛋白濃度，其余加入6×Loading buffer（1∶5體積比）后在沸水中煮沸5 min變性。取30 μg所提蛋白使用SDS-PAGE凝膠進行分離和轉(zhuǎn)膜，PVDF膜使用5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入目的抗體置于4℃冰箱的搖床上過夜孵育。TBST洗膜液洗膜10 min×3次，加入二抗置于常溫搖床進行孵育1 h。TBST洗膜液洗膜10 min×3次，使用ECL顯影液進行顯影。目的蛋白表達量通過與內(nèi)參蛋白β-actin標準化后得到相對比值。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測相關(guān)mRNA表達

M14和A375細胞常規(guī)培養(yǎng)，使用胰酶消化并傳代細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁生長至60%～70%時使用飛捷RNAfast 200提取RNA，方法參照試劑說明書進行操作。使用TaKaRa Prime ScriptTMRT Master Mix RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得 cDNA 模板，逆轉(zhuǎn)錄體系參照試劑說明書。使用TaKaRa SYBR ?Primix Ex TaqTMⅡ反應(yīng)體系檢測 mRNA 表達檢測。引物序列：IRE1，正向5'-CACAGTGACGCTTCCTGAA AC-3'，反向5'-GCCATCATTAGGATCTGGGAGA-3'。應(yīng)用β-actin作為內(nèi)參，正向5'-CATGTACGTTGCTA TCCAGGC-3'，反向 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。mRNA的表達水平采用2-△△Ct計算方法進行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差分析的兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6-姜辣素抑制黑色素瘤細胞增殖能力

體外使用不同濃度6-姜辣素處理M14和A375細胞，不同濃度組間細胞存活率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與對照組比較，6-姜辣素抑制M14和A375細胞增殖且呈濃度依賴性，測得對M14和A375細胞半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為46.070和33.152μmol/L，根據(jù)IC50濃度選擇分別選擇40/60和20/40μmol/L濃度進行后續(xù)實驗。見附表。

附表 黑色素瘤M14和A375細胞存活率比較 （%，±s）

附表 黑色素瘤M14和A375細胞存活率比較 （%，±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05

細胞 0μmol/L 10μmol/L 20μmol/L 40μmol/L 60μmol/L 80μmol/L F 值 P值M14 細胞 100.000±11.528 93.367±10.382 75.263±4.516? 60.085±14.284? 42.286±8.183? 20.000±12.415? 43.970 0.000 A375細胞 100.000±4.855 86.752±5.931 60.349±6.584? 40.174±4.85? 31.671±9.745? 20.000±6.854? 102.610 0.000

2.2 6-姜辣素對黑色素瘤細胞凋亡的影響

與0μmol/L組比較，6-姜辣素上調(diào)M14細胞（見圖1A）和A375細胞（見圖1B）Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP蛋白水平。

6-姜辣素60μmol/L處理M14細胞24h后細胞凋亡率為（28.88±2.24）%（早期+晚期凋亡率）（見圖2A、2B），與 0μmol/L組凋亡率（6.72±1.27）%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=38.504，P =0.000）。6-姜辣素40μmol/L處理A375細胞24h，細胞凋亡率為（34.01±3.17）%（早期+晚期凋亡率）（見圖2C、2D），與0μmol/L組凋亡率（7.97±1.69）%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=32.417，P =0.000）。

2.3 6-姜辣素對黑色素瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

M14（見圖3A）和A375（見圖3B）細胞BIP、IRE1和JNK蛋白表達上調(diào)。

2.4 6-姜辣素對IRE1/JNK信號通路的影響

Western blotting（見圖4A） 和 qRT-PCR（ 見圖4B）結(jié)果顯示IRE1被基因敲減。6-姜辣素處理IRE1基因敲減細胞，MTT結(jié)果表明IRE1基因敲減后6-姜辣素抑制增殖能力減弱（見圖4C），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.133，P =0.039）；Western blotting檢測結(jié)果顯示，IRE1基因敲減后合用6-姜辣素Cleaved-Caspase-3表達減少（見圖4D）。

圖1 6-姜辣素對凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP表達的影響

圖2 6-姜辣素對黑色素瘤細胞凋亡的影響

圖3 6-姜辣素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP、IRE1和JNK表達的影響

圖4 6-姜辣素對IRE1/JNK信號通路的影響

3 討論

惡性黑色素瘤在臨床較為常見的皮膚黏膜和色素膜惡性腫瘤，具有進展快、預(yù)后差和病死率高等特點，黑色素瘤對放療和化療不敏感，導(dǎo)致其治療效果不佳。因此選擇有效性治療惡性黑色素瘤的藥物對于提高其預(yù)后顯得尤為關(guān)鍵。

6-姜辣素是從生姜中提取的最具生物活性部分，既往文獻發(fā)現(xiàn)6-姜辣素抑制乳腺癌細胞侵襲遷移[9]，此外其在腎癌、前列腺癌和宮頸癌等疾病中通過促進凋亡發(fā)揮抗癌效果。本研究發(fā)現(xiàn)它能抑制黑色素瘤增殖，并呈濃度依賴性和時間依賴性。同時發(fā)現(xiàn)6-姜辣素上調(diào)細胞內(nèi)Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP蛋白表達水平，表明其促進黑色素瘤細胞凋亡的發(fā)生。同時本實驗中使用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測6-姜辣素對凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)其促進黑色素瘤細胞凋亡的發(fā)生。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum,ER）作為細胞內(nèi)細胞器主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成、折疊、成熟與分泌。多種生理或病理條件如蛋白質(zhì)糖基化的抑制、缺氧、饑餓、鈣離子流失等會導(dǎo)致細胞內(nèi)未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚集，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損而不能發(fā)揮正常生理功能，該現(xiàn)象被稱為ERs[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為恢復(fù)細胞正常功能，會通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response,UPR）來保護細胞免受 ERs所引起的損傷。UPR是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose-regulated protein 78,GRP78）/BIP以及3個應(yīng)激感受蛋白來介導(dǎo)[11]。當(dāng)ERs不存在時，3個應(yīng)激感受蛋白會與分子伴侶GRP78/BIP結(jié)合處于失活狀態(tài)；當(dāng)ERs存在時，分子伴侶GRP78/BIP與3個應(yīng)激感受蛋白解離從而啟動UPR反應(yīng)保護細胞正常功能。IRE1是介導(dǎo)ERs信號通路的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白之一，當(dāng)ERs長期存在不能緩解時，會導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生[12]，其中IRE1會通過激活下游JNK信號通路引起細胞凋亡[8]。本研究中顯示，6-姜辣素處理后細胞BIP、IRE1和JNK蛋白表達水平上調(diào)，表明6-姜辣素引起黑色素瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。并發(fā)現(xiàn)IRE1基因高敲減后6-姜辣素的促凋亡作用減弱，驗證6-姜辣素可通過IRE1/JNK信號通路發(fā)揮功能。

綜上所述，6-姜辣素抑制黑色素瘤細胞增殖并促進其凋亡發(fā)生，激活I(lǐng)RE1/JNK內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路是其可能的分子機制，進一步深入探討6-姜辣素治療黑色素瘤的分子機制，將有可能為黑色素瘤的綜合治療帶來新的選擇。