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    黑豆皮中原花青素含量測定及抗氧化活性研究

    2019-03-19 05:16:12李代魁李忠平
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2019年3期
    關(guān)鍵詞:黑豆花青素樹脂

    李 勇,李代魁,李忠平,董 川

    (山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所,山西太原 030006)

    0 引言

    原花青素(Proanthocyanidins,簡稱PC) 是重要的一類植物次生代謝產(chǎn)物,最早是從松樹皮中提取出來的,隨后陸續(xù)從葡萄、蘋果、山楂、蓮蓬、銀杏、可可、柳樹葉、白樺樹等植物的皮、核或種子中發(fā)現(xiàn)了原花青素[1]。原花青素是一類自然發(fā)生的黃烷醇聚合而成的多酚類物質(zhì),按聚合度的大小將二至四聚體統(tǒng)稱為低聚體(OPC),將五聚體及其以上的縮合體統(tǒng)稱為高聚體(PPC)[2]。在所有類型的原花青素里,二聚體來源最廣,對其的研究也最多[3]。原花青素具有豐富的藥理活性,根據(jù)文獻(xiàn)報道[4-8],PC具有抗菌、抗癌、抗病毒、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)的作用。因此,PC在化妝品、營養(yǎng)、醫(yī)療保健等領(lǐng)域越來越受到人們的青睞。

    我國自古以來就有“大豆數(shù)種,唯黑入藥”的歷史記載,黑豆皮在我國古代中藥中具有重要的藥用地位[9]。對黑豆皮及子葉中的物質(zhì)組分進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn),黑豆皮中的多酚類物質(zhì)含量較高,特別是花青素和原花青素等化學(xué)物質(zhì)[10-11]。黑豆是一種集食用、保健、藥用于一體的豆類品種,但其中的原花青素的提取與測定方法文獻(xiàn)報道較少。因此,試驗(yàn)選取黑豆皮為原材料,以乙醇為提取劑,提取和純化原花青素,并建立原花青素的HPLC分析方法,旨在確定快速、準(zhǔn)確、可靠的分離分析黑豆皮中PC的方法,同時為黑豆皮的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù),為黑豆皮的深加工工業(yè)化生產(chǎn)提供可能性。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    黑豆皮,購于太原市某農(nóng)貿(mào)市場。

    原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%),上海哈靈生物科技有限公司提供;乙醇、甲醇、鹽酸,均為分析純;HPLC甲醇為色譜級、ABTS(2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸),Aladdin公司提供。

    電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品;超聲波清洗器,天鵬電子新技術(shù)有限公司產(chǎn)品;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph/G3)、紫外-可見分光光度計,珀金埃爾默儀器上海有限公司產(chǎn)品;安捷倫HPLC-1200型高效液相色譜儀。

    原花青素對照品見圖1。

    圖1 原花青素對照品

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    準(zhǔn)確稱取2.00 mg原花青素溶于2.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸甲醇溶液中,配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。從標(biāo)準(zhǔn)儲備液中吸取一定量,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸水溶液稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)5,50,100,250,500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品待測液,用0.45 μm濾膜過濾,取20 μL上樣。

    1.2.2 供試品溶液的制備

    稱取黑豆皮樣品各20 g,加入200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇,于室溫下超聲處理3次,每次15 min;采用布氏漏斗過濾,得濾液。濾渣再用200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸的乙醇溶液重復(fù)提取2次,將3次濾液合并,于40℃下真空濃縮去除乙醇,然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸的去離子水定容至10 mL備用。

    將上述提取液經(jīng)Sepabeads SP700型大孔樹脂柱分離,去除提取物可能含有的脂溶性成分、非極性糖類成分、有機(jī)酸類。用水,體積分?jǐn)?shù)為10%,30%,60%,90%的乙醇水溶液各200 mL分別洗脫粗提物,用5個錐形瓶分別接取洗脫液,分別經(jīng)過旋蒸儀減壓濃縮后,用色譜純甲醇或去離子水溶解濃縮產(chǎn)物,用色譜甲醇定容至5 mL,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜過濾,濾液作為供試品溶液I,II,III,IV,Ⅴ于冰箱中冷藏。

    1.2.3 色譜條件

    色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱,四元泵;流動相A為水(含2%冰醋酸水溶液),流動相B為甲醇;流速1 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,柱溫30℃,檢測波長280 nm。梯度條件:0~25 min,10%~30%B;25~32 min, 30%-80%B; 32~50 min,80% ~100%B;50~60 min,100%B;60~61min,100%~10%B。

    1.2.4 ABTS法

    使用ABTS法測抗氧化性,在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[12]稍加修飾。取10 μL的樣品溶液加入2 mL ABTS+溶液避光反應(yīng)2 min,空白試驗(yàn)加入2 mL水反應(yīng)2 min。

    ABTS+溶液的配置:用天平稱取54.8 g ABTS+溶于20 mL磷酸鹽緩沖液(pH值7.0),加入1 g的MnO2,活化20 min。取2 mL活化好的溶液離心,用磷酸緩沖溶液稀釋上清液,使其A734(t0)=0.800±0.02 nm。然后于734 nm處測量吸光度。以維C作為對照,計算IC50值。

    依據(jù)以下公式,可以計算出ABTS+的清除率:

    式中:A0——空白溶液的吸光度值;

    At——樣品與ABTS+反應(yīng)后的吸光度值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 方法的專屬性

    對于樣品I,II,III,IV,V和標(biāo)準(zhǔn)品待測液進(jìn)行HPLC測定,發(fā)現(xiàn)IV和標(biāo)準(zhǔn)品待測液在47.3 min左右的時間內(nèi)出峰,再在IV樣品中加入了適量的標(biāo)準(zhǔn)品待測液,對其進(jìn)行HPLC測定,發(fā)現(xiàn)峰面積明顯變大,確定IV樣品中含有原花青素,而其他樣品中未檢測出明顯的目標(biāo)峰。以30%乙醇水洗脫得到的組分色譜圖為例,如圖2所示。

    30%乙醇水溶液洗脫得到的組分色譜圖見圖2。

    圖2 30%乙醇水溶液洗脫得到的組分色譜圖

    由圖2可見,30%乙醇水溶液洗脫得到的組分色譜圖中,在47.3 min附近無明顯的色譜峰,因此不采用這一洗脫液的組分進(jìn)行黑豆皮原花青素的含量分析,同理,在水、10%乙醇水、90%乙醇水中均未檢測出明顯的目標(biāo)峰,因此都被排除,而采用60%乙醇水作為樹脂柱洗脫液得到的組分來進(jìn)行原花青素的含量分析,其他洗脫液的目的在于分離無關(guān)雜質(zhì),方便HPLC分析。

    原花青素對照品、樣品I、樣品I+對照品色譜圖見圖3。

    圖3 原花青素對照品、樣品I、樣品I+對照品色譜圖

    2.2 檢測波長的選擇

    取適量的原花青素標(biāo)品,對其進(jìn)行紫外掃描,從得到的圖形中可以看出原花青素在280 nm左右的地方有最大吸收,280 nm處為其特征吸收,所以確定280 nm作為高效色譜的檢測波長。

    原花青素對照品的紫外圖譜見圖4。

    2.3 線性關(guān)系與檢測限

    由1.2.1配置的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在1.2.3的色譜條件下,經(jīng)高效液相色譜儀測得原花青素的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積,結(jié)果表明PC在5~500 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為Y=3.578 9X-41.036,R2=0.980 5,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。經(jīng)HPLC測定,當(dāng)PC峰高為儀器響應(yīng)噪聲的3倍量時,檢測限為1 000 ng (S/N=3)。

    圖4 原花青素對照品的紫外圖譜

    PC標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

    圖5 PC標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.4 精密度試驗(yàn)

    取質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品待測液,連續(xù)進(jìn)樣5次HPLC測定,計算其峰面積,RSD為3.72%,儀器具有良好的精密度。

    2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取I號樣品分別于0,2,4,8,12 h各進(jìn)樣一次HPLC測定,計算其峰面積,RSD為3.70%,證明在12 h內(nèi)樣品的穩(wěn)定性可以得到保證。

    2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

    精密稱取黑豆皮樣品5份,每份都是20 g,重復(fù)進(jìn)行樣品的制備工作,對5次制備所得的I號樣品各進(jìn)行1次HPLC測定,計算其峰面積,RSD為2.26%,表明了該試驗(yàn)具良好的重現(xiàn)性。

    2.7 加樣回收試驗(yàn)

    取上述已經(jīng)測得原花青素含量的I號樣品共1.5 mL,平均分配到1,2,3號小瓶中,再用質(zhì)量濃度100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品待測液定容至1 mL,分別上樣進(jìn)行HPLC 測定,計算得到回收率分別為106.13%,95.85%,102.30%,平均回收率101.43%,RSD為1.46%,結(jié)果顯示該試驗(yàn)回收率良好。

    2.8 樣品含量測定

    精密稱取黑豆皮樣品5份,每份都是20 g,按1.2.2節(jié)樣品處理方法制備,測定各供試品溶液的峰面積,計算原花青素的含量。

    黑豆皮PC含量的測定見表1。

    2.9 ABTS+的清除能力比較

    黑豆皮原花青素的ABTS+清除能力見圖6。

    表1 黑豆皮PC含量的測定(n=5)

    圖6 黑豆皮原花青素的ABTS+清除能力

    通過測定某物質(zhì)清除自由基的能力,即可表征其抗氧化活性強(qiáng)弱[11]。圖6顯示了黑豆皮中原花青素提取物對于ABTS+的清除效果明顯,隨著質(zhì)量濃度的增加,清除能力增強(qiáng),即其抗氧化活性與質(zhì)量濃度間存在量效關(guān)系。半抑制量(IC50)為13.62 μg/mL,遠(yuǎn)小于陽性對照維C 98.23 μg/mL。

    3 結(jié)論

    研究采用吸附樹脂分離純化原花青素,分別通過對HP20型大孔樹脂、AB-8型樹脂、D101型樹脂、Sepabeads SP700型大孔樹脂的純化過程進(jìn)行摸索,經(jīng)HPLC法分析,結(jié)果在相同質(zhì)量濃度的情況下,Sepabeads SP700型大孔樹脂純化的原花青素峰面積最大,因此Sepabeads SP700型吸附樹脂可以很好地富集原花青素。

    黑豆為山西地產(chǎn)特色農(nóng)作物,在山西呂梁地區(qū)資源豐富,試驗(yàn)采用HPLC法測定山西產(chǎn)地黑豆皮中原花青素的含量,結(jié)果表明,該測定法準(zhǔn)確、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高。近年來,黑豆皮藥食性的研究應(yīng)用越來越受到廣泛關(guān)注,其應(yīng)用潛力越來越大,試驗(yàn)為黑豆皮的原花青素品質(zhì)綜合評價及控制提供參考依據(jù)。黑豆皮中的不同官能團(tuán)的原花青素及其對抗氧化活性的影響,還有待于進(jìn)一步研究與開發(fā)。

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