電針對(duì)不同階段SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)及β-淀粉樣蛋白、Tau蛋白水平的影響

楊文丹 駱雍陽(yáng) 李斐斐 洪苗苗 王豐 鄭雪花 董衛(wèi)國(guó)

摘要：目的? 觀察電針“百會(huì)”“大椎”“腎俞”對(duì)3月齡及9月齡SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)β-淀粉樣蛋白（Aβ）、Tau蛋白表達(dá)的影響，探討電針治療阿爾茨海默病的時(shí)機(jī)。方法? 將SAMP8小鼠隨機(jī)分為早期電針組（3月齡電針干預(yù)）、晚期電針組（9月齡電針干預(yù)）、模型組，以同齡正常老化SAMR1小鼠為對(duì)照組，并均于10月齡取材。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，透射電鏡觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組化檢測(cè)小鼠海馬區(qū)Aβ、Tau蛋白的表達(dá)。結(jié)果 ?與晚期電針組比較，早期電針組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P<0.05），跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P<0.05），海馬區(qū)Aβ、Tau蛋白異常表達(dá)明顯減少（P<0.05），突觸結(jié)構(gòu)較完整，數(shù)量增加。結(jié)論? 電針能提高SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，降低小鼠海馬區(qū)Aβ、Tau蛋白的異常表達(dá)，改善神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，且其療效早期介入優(yōu)于晚期介入。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默病;電針;學(xué)習(xí)記憶;超微結(jié)構(gòu);β-淀粉樣蛋白;Tau蛋白;SAMP8小鼠

中圖分類號(hào)：R245 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）02-0057-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.013

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture （EA） “Baihui”， “Dazhui”， and “Shenshu” on learning memory ability， ultrastructure of neurons， and expressions of Aβ and Tau in three-month old and nine-month old SAMP8 mice; To discuss the timing of EA for the treatment of Alzheimer disease （AD）. Methods SAMP8 mice were randomly divided into three groups： early-stage-EA group （3-month-old EA）， advanced-stage-EA group （9-month-old EA） and model group. Normally aged SAMR1 mice of the same age were set as the control group. Finally all mice were sacrificed in ten-month old. The learning and memory ability of mice was detected by Morris water maze test. The ultrastructural changes of hippocampal CA1 region were observed by transmission electron microscopy. The expressions of Aβ and Tau in hippocampus of mice were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the advanced-stage-EA group， the escape latency of the early-stage-EA group was significantly shortened （P<0.05）; the time spent in target quadrant was prolonged （P<0.05）; the number of crossing was expanded （P<0.05）; the aberrant expressions of Aβ and Tau in hippocampal CA1 region was attenuated （P<0.05）; synaptic structure was more complete and the synaptic number increased. Conclusion EA can improve the learning and memory ability of SAMP8 mice， reduce the abnormal expressions of Aβ and Tau protein in hippocampus of mice， and ameliorate the ultrastructure of neurons. Especially the early intervention is superior to the late intervention.

Keywords： Alzheimer disease; electroacupuncture; learning and memory; ultrastructure; Aβ; Tau; SAMP8 mice

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病^[1]。AD的主要病理特征為細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成的老年斑（SP）和細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化Tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFTs）^[2]。在AD早期即出現(xiàn)突觸障礙等特征^[3-4]。針灸治療AD具有多途徑、多水平、多方式、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，且療效可靠、不良反應(yīng)少^[5-6]。我們前期研究表明，益腎調(diào)督法電針能改善SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和突觸超微結(jié)構(gòu)，且能抑制Aβ的產(chǎn)生^[7-8]。本實(shí)驗(yàn)以SAMP8小鼠為AD模型，比較電針對(duì)不同年齡段（3月齡和9月齡）SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)及Aβ、Tau蛋白水平的影響，為電針治療AD的時(shí)機(jī)選擇提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 動(dòng)物

SAMP8小鼠36只及對(duì)抗快速老化小鼠亞系 SAMR1小鼠12只，3月齡，雄性，體質(zhì)量20～25 g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部），動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0010。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（55±15）%，12 h明暗交替，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程均嚴(yán)格按照國(guó)際動(dòng)物保護(hù)及使用指南的規(guī)定進(jìn)行，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2? 主要試劑與儀器

華佗牌無(wú)菌針灸針（0.25 mm×15 mm）、華佗牌SDZ-Ⅱ電針儀，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;Morris水迷宮系統(tǒng)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;H-7650型透射電鏡，日本Hitachi公司;電鏡CCD相機(jī)-圖像采集分析系統(tǒng)，德國(guó)Soft-Imaging-System公司。Tau （Tau-5）單克隆抗體（AHB0042），Thermo Fisher Scientific公司;Anti-β-Amyloid（6E10）單克隆抗體（SIG-39300），Covance/Biolegend公司;UltraSensitive TMS-P超敏試劑盒 （鼠/兔）與DAB試劑盒，福州邁新生物工程有限公司;Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。

1.3? 分組

將36只SAMP8小鼠隨機(jī)分為模型組、早期電針組、晚期電針組（由3月齡SAMP8小鼠喂養(yǎng)至9月齡），每組12只。將12只SAMR1小鼠作為空白對(duì)照組。

1.4? 干預(yù)

根據(jù)前期研究，采用自制網(wǎng)兜固定小鼠，選取“百會(huì)”“大椎”及雙側(cè)“腎俞”進(jìn)行電針治療^[7-8]，取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》^[9]，“百會(huì)”向前斜刺2 mm，“大椎”向下斜刺2～3 mm，“腎俞”稍向內(nèi)斜刺3～4 mm，其中電針正負(fù)極分別施于“大椎”“腎俞”（雙側(cè)交替）。進(jìn)針后，不進(jìn)行手法刺激，連接電針儀進(jìn)行治療，施以連續(xù)波，頻率2 Hz，電流強(qiáng)度以小鼠肢體微顫為宜。留針20 min，每日1次，8 d為1個(gè)療程，療程間隔2 d，共3個(gè)療程，計(jì)30 d。早期電針組和晚期電針組分別在3月齡和9月齡進(jìn)行電針干預(yù)，模型組和空白對(duì)照組不進(jìn)行電針干預(yù)，在相同時(shí)間以相同方式固定和抓握。最終48只小鼠均在10月齡于水迷宮實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行取材。

1.5? Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮測(cè)試包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。水迷宮外觀為直徑120 cm、高60 cm、水深15 cm的圓形水池，水池側(cè)面均光滑;控制水溫為（25±2）℃，給予小鼠圓形站立平臺(tái)直徑為8 cm，平臺(tái)位于第三象限，沒(méi)于水下1 cm。定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)每日分上午、下午2個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段小鼠訓(xùn)練4次，將小鼠分別從4個(gè)入水點(diǎn)（各象限池壁中點(diǎn)）面向池壁放入水中，記錄小鼠爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期，如90 s內(nèi)未找到平臺(tái)則將其引至平臺(tái)并在平臺(tái)停留10 s，記錄逃避潛伏期為90 s，連續(xù)進(jìn)行5 d?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第6日撤去平臺(tái)，將小鼠從第一象限池壁中點(diǎn)放入池中，自由游泳90 s后結(jié)束實(shí)驗(yàn);記錄小鼠在原平臺(tái)象限停留時(shí)間與跨越平臺(tái)次數(shù)。

1.6? 透射電鏡觀察

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，迅速取出腦組織，置于2.5%戊二醛固定液中，分離出海馬，切取左右兩側(cè)海馬CA1區(qū)約1 mm×1 mm×1 mm，左右兩側(cè)各取3～4小塊，3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定3 d，1%鋨酸水溶液4 ℃后固定2 h，梯度乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑包埋，37、45、60 ℃分別聚合，常規(guī)半薄切片，美蘭-天青染色，光鏡觀察并定位，常規(guī)超薄切片，銅網(wǎng)撈片，切片分別經(jīng)2%醋酸鈾水溶液染色20 min，檸檬酸鉛染色15 min;透射電鏡觀察切片，先在低倍鏡下全面定位和觀察海馬神經(jīng)元，再在高倍鏡下觀察突觸形態(tài)，并用電鏡CCD相機(jī)進(jìn)行圖像采集與分析。

1.7? 免疫組化染色

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，快速注入37 ℃生理鹽水80 mL沖洗，后注入4%多聚甲醛80 mL灌流固定。取全腦修塊后迅速放入4%多聚甲醛內(nèi)4 ℃固定24～48 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。自上丘至視交叉節(jié)段作冠狀連續(xù)切片（厚4 μm）。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，將黏附腦組織的載玻片置于0.01 mol/L檸檬酸修復(fù)液（pH 6.0），微波爐法抗原修復(fù)8 min，降至室溫。UltraSensitive TMS-P超敏試劑盒（鼠/兔）檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。一抗加入Tau-5抗體（1∶200）、6E10抗體（1∶100），4 ℃濕盒中孵育過(guò)夜。加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG二抗，DAB顯色，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)海馬CA1區(qū)Aβ、Tau-5的圖片進(jìn)行分析，計(jì)算Aβ及Tau-5的平均光密度（MOD）。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，原平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)減少（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，早期電針組和晚期電針組小鼠逃避潛伏期縮短，原平臺(tái)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)，跨越原平臺(tái)次數(shù)增加（P<0.05，P<0.01）;與晚期電針組比較，早期電針組平均逃避潛伏期、停留時(shí)間及跨越原平臺(tái)次數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1和表2。

2.2? 透射電鏡觀察結(jié)果

空白對(duì)照組突觸結(jié)構(gòu)完整，突觸前、后膜分界清晰，突觸小泡密集，溶酶體與脂褐素?cái)?shù)量較少;模型組突觸結(jié)構(gòu)不完整，突觸前、后膜分界不清，突觸小泡密集溶酶體與脂褐素?cái)?shù)量最多;晚期電針組和早期電針組突觸數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)清晰完整且早期電針組較晚期電針組突觸結(jié)構(gòu)更好。

2.3? 免疫組化染色結(jié)果

光鏡下小鼠海馬CA1區(qū)Aβ主要沉積于神經(jīng)元外，微管相關(guān)蛋白Tau主要位于神經(jīng)元胞質(zhì)中。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠Aβ陽(yáng)性表達(dá)不明顯，Tau陽(yáng)性表達(dá)明顯，MOD值均明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，晚期電針組和早期電針組小鼠Aβ和Tau MOD值明顯降低（P<0.01），且早期電針組降低更明顯（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表3。

3? 討論

AD屬中醫(yī)學(xué)“呆癥”“健忘”等范疇，人至老年，腎精漸衰，髓海不足，加之脾虛生痰，痰濁蒙竅則呆鈍善忘。百會(huì)位于頭之巔頂，為百脈之所會(huì)，內(nèi)應(yīng)于腦，《黃帝明堂灸經(jīng)》記載百會(huì)主治“忘前失后，心神恍惚”。其具有開(kāi)竅醒神、補(bǔ)腦益智之功，為治療髓海不足健忘、老年性癡呆的要穴。大椎為手足三陽(yáng)經(jīng)與督脈之交會(huì)穴，總督一身之陽(yáng)氣，是升陽(yáng)開(kāi)竅，健腦調(diào)神的效穴。大椎與百會(huì)均在督脈上，兩穴結(jié)合可使諸經(jīng)通調(diào)，促進(jìn)經(jīng)氣的運(yùn)行，增強(qiáng)了聯(lián)絡(luò)各臟腑經(jīng)絡(luò)的功效，增加了濡養(yǎng)腦髓的氣血，促進(jìn)了陰陽(yáng)平衡的調(diào)節(jié);腎俞位于膀胱經(jīng)上，具有補(bǔ)益腎臟、充填腦髓、健腦的功效，《靈樞·經(jīng)脈》記載“足太陽(yáng)膀胱之脈……其直者，從巔入絡(luò)腦”。腎為先天之本，藏精、生髓。腎俞是腎臟的背俞穴，腎中精氣都匯集于此穴，腎經(jīng)與督脈相連，一起入髓聯(lián)絡(luò)腦海，共同主宰一身的陽(yáng)氣。三穴相配共奏益腎調(diào)督的作用。因此，結(jié)合經(jīng)典論述并參考“益腎調(diào)督”電針?lè)ㄖ委烝D的相關(guān)文獻(xiàn)^[10-13]及我們前期研究^[7-8]，本實(shí)驗(yàn)選取大椎、百會(huì)、腎俞為治療腧穴。

AD主要病理特征是Aβ沉積、高度磷酸化Tau蛋白及突觸障礙等，集中發(fā)生在和學(xué)習(xí)記憶功能與信息處理密切相關(guān)的海馬、大腦皮質(zhì)等部位。Aβ是由β-淀粉樣前體蛋白（APP）降解所產(chǎn)生，其在腦內(nèi)位于細(xì)胞外，主要以Aβ40和Aβ42形式存在，其中含量較低的Aβ42易于聚集為原纖維而沉積形成彌漫性SP。AD大腦中Aβ異常表達(dá)，高濃度Aβ對(duì)成熟的神經(jīng)元有毒性作用，可致細(xì)胞凋亡、Tau蛋白過(guò)磷酸化，最終形成SP和NFTs等。Tau蛋白是一種能與微管蛋白相結(jié)合，并對(duì)微管的形成起促進(jìn)與穩(wěn)定作用的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白。AD患者腦中Tau蛋白發(fā)生異常修飾，有過(guò)度糖基化、磷酸化和泛素化而形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。異常磷酸化的Tau蛋白有不可溶性，會(huì)阻礙微管組裝，導(dǎo)致神經(jīng)元骨架蛋白結(jié)構(gòu)異常和神經(jīng)元死亡。因此，Aβ和Tau蛋白常作為AD的治療靶點(diǎn)和觀測(cè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與晚期電針組和模型組比較，早期電針組能顯著降低AD模型Aβ和Tau蛋白的水平。

SAMP8小鼠是由日本京都大學(xué)竹田俊男培育成功并被廣泛應(yīng)用于AD研究的動(dòng)物模型，其特點(diǎn)是學(xué)習(xí)記憶功能隨年齡進(jìn)行性快速衰退。SAMP8小鼠腦內(nèi)的神經(jīng)病理學(xué)變化能較好地模擬AD腦內(nèi)的病理變化。有研究表明，4月齡SAMP8小鼠即出現(xiàn)包括學(xué)習(xí)記憶力損害的行為異常改變表型，5月齡SAMP8小鼠腦內(nèi)即出現(xiàn)Tau蛋白增多及Tau蛋白高度磷酸化，6月齡SAMP8小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)即有Aβ蛋白的異常沉積^[14-16]。本實(shí)驗(yàn)采用SAMP8小鼠為AD模型;SAMR1小鼠有與SAMP8小鼠相似的遺傳背景，但未表現(xiàn)衰老相關(guān)的神經(jīng)顯型，作為空白對(duì)照。

美國(guó)國(guó)立老化研究院（NIA）和阿爾茨海默病協(xié)會(huì)（AA）于2011年發(fā)表NIA-AA診斷標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)AD的連續(xù)性，病理生理進(jìn)程在AD臨床癥狀出現(xiàn)的15～20年前就已開(kāi)始，并將AD分為3個(gè)階段，即AD臨床前階段、AD源性輕度認(rèn)知障礙和AD癡呆階段。將AD的臨床前無(wú)癥狀階段也納入了AD，這大大地前移了AD的診斷。IWG-1診斷標(biāo)準(zhǔn)首次將生物標(biāo)記物（包括腦脊液Aβ1-42的下降、總Tau蛋白或磷酸化Tau蛋白的升高等）納入AD診斷，并將早期輕度認(rèn)知障礙階段也歸入AD的診斷;此外，基因檢測(cè)為AD的早期臨床治療提供了可能性。

大量研究顯示，電針可改善AD模型學(xué)習(xí)記憶能力與突觸超微結(jié)構(gòu)，并抑制其腦內(nèi)Aβ及Tau蛋白的異常表達(dá)^{[7-8，17-19]}。已有研究顯示電針“早治療”的優(yōu)勢(shì)，與缺血形成后治療比較，早期督脈電針慢性腦缺血大鼠可明顯降低炎性因子含量^[20];早期電針治療能顯著增加局灶性腦缺血大鼠缺血腦皮質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的蛋白和mRNA表達(dá)^[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，早期電針對(duì)AD模型療效較好，這一結(jié)果正契合中醫(yī)“未病先防，既病防變”的“治未病”理論。

本研究以3月齡SAMP8小鼠模擬AD早期，即未見(jiàn)明顯記憶力減退及Aβ、Tau蛋白異常表達(dá)時(shí)期;以9月齡SAMP8小鼠模擬AD晚期，即記憶力減退及Aβ、Tau蛋白顯著異常表達(dá)時(shí)期。2組均采取電針干預(yù)，檢測(cè)并對(duì)比行為學(xué)及病理狀態(tài)均不同的2個(gè)時(shí)點(diǎn)電針干預(yù)后的效果，為臨床電針治療AD時(shí)機(jī)的選擇提供參考。目前，AD發(fā)病機(jī)制尚不明確且缺乏特效藥，臨床多是在AD中晚期才發(fā)現(xiàn)并介入治療，效果差強(qiáng)人意。

綜上，AD早期電針介入能有效改善SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、突觸超微結(jié)構(gòu)，減少Aβ、Tau蛋白的異常表達(dá)，其療效優(yōu)于AD晚期電針介入治療。這一結(jié)果與“AD應(yīng)早期治療”的觀點(diǎn)相吻合。但電針對(duì)SAMP8小鼠的療效是否隨月齡成幾何相關(guān)及其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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