關節(jié)軟骨干／祖細胞治療關節(jié)軟骨缺損研究進展

譚喬燕 李燦 謝楊麗 羅鳳濤 杜曉蘭 陳林

關節(jié)軟骨由于自身修復能力極差，在長期負荷運轉(zhuǎn)中一旦受到異常應力、機械創(chuàng)傷等損傷，往往逐漸引起軟骨退變及關節(jié)其他組分病變，誘發(fā)骨關節(jié)炎（OA）。目前OA治療主要是非手術治療［1］，藥物治療主要圍繞緩解疼痛、抑制炎癥等方面，如口服甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥，而物理治療主要對持續(xù)性疼痛采取關節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸、類固醇激素與富含血小板的血漿等。這些治療難以從根本上緩解OA進展，到OA晚期，全關節(jié)置換術是患者僅有的有效治療措施，而到此階段，患者生活質(zhì)量已長時間受到嚴重影響，且并發(fā)癥多。激活內(nèi)源性干／祖細胞適用于較小面積的損傷修復，創(chuàng)傷或疾病引起的關節(jié)表面大面積缺損可以借助軟骨組織工程移植重建。關節(jié)軟骨干／祖細胞作為軟骨組織工程種子細胞，存在于Ranvier環(huán)、脂肪墊、滑膜、軟骨膜、關節(jié)軟骨表層和顳下頜關節(jié)髁突表層。

1 軟骨膜凹槽Ranvier環(huán)干細胞

1873年，Ranvier在骨骺板周圍發(fā)現(xiàn)1個環(huán)形軟骨膜凹槽，并命名為Ranvier環(huán)。1977年，Shapiro等［2］發(fā)現(xiàn)在Ranvier環(huán)有一群形態(tài)類似間充質(zhì)干細胞的增殖細胞。在胚胎發(fā)育早期，Ranvier環(huán)與骨領幾乎同時形成，肥大前軟骨細胞與骨領相鄰并被Ranvier骨化槽環(huán)繞，骨領與肥大前軟骨細胞始終處于同一水平，Ranvier環(huán)是骨領形成的主要細胞來源［3］。Ranvier環(huán)區(qū)成纖維細胞與干骺端骨膜的延續(xù)稱為LaCorix軟骨膜環(huán)，去除LaCorix軟骨膜環(huán)可導致肢體生長停止［4］。1999年，Robinson等［5］從新生大鼠的LaCorix軟骨膜環(huán)中分離出前體細胞，并通過成纖維細胞生長因子受體-3免疫磁珠純化分選，進一步研究發(fā)現(xiàn)這群細胞具有增殖并定向分化為軟骨細胞的潛能。Karlsson等［6］為進一步研究Ranvier環(huán)處這群細胞的干／祖細胞特性，連續(xù)12 d注射溴脫氧尿苷（Brdu）標記3月齡新西蘭白兔關節(jié)軟骨細胞，第1次注射后分別在第4、6、10、14、28和56天取材，結(jié)果標記后10 d，免疫組化檢測顯示在骺板、軟骨膜凹槽Ranvier環(huán)及關節(jié)軟骨全層有大量Brdu陽性細胞，標記后56 d，在軟骨膜凹槽Ranvier環(huán)處發(fā)現(xiàn)存在一群更新緩慢的細胞，這些細胞表達干／祖細胞相關標記物如Stro-1、Jagged1、BMPr1a等，進一步確認 Ranvier環(huán)存在軟骨干／祖細胞。

2 髕骨下脂肪墊干細胞

脂肪組織也是獲取干細胞的重要來源之一，自2001年Zuk等報道從脂肪組織分離間充質(zhì)干細胞以來，脂肪間充質(zhì)干細胞已被證實可誘導分化成多種細胞表型。髕骨下脂肪墊干細胞（IPFPSC）來源于脂肪，易提取，體外擴增快，逐漸得到學者們的認可。有研究從全膝關節(jié)置換患者髕骨下脂肪墊分離一群細胞，流式檢測顯示其間充質(zhì)干細胞標志物CD44和CD105呈陽性，體外三系誘導分化結(jié)果顯示具有成軟骨、成骨與脂肪的能力，因此認為這群細胞具有典型的干細胞特征［7］。Liu等［8］研究發(fā)現(xiàn)，從OA患者分離的IPFPSC與韌帶重建患者分離的IPFPSC具有相當?shù)能浌巧赡芰?；IPFPSC通過增加蛋白聚糖基因的表達來增加硫酸糖胺聚糖的表達；進一步研究IPFPSC是否滿足臨床軟骨組織工程移植尺寸（直徑≥2 cm）的需求，將IPFPSC接種于電紡左旋聚乳酸（PLLA）纖維膜，培養(yǎng)6周，出現(xiàn)彈性的軟骨樣移植物，證實從OA患者分離的IPFPSC有用于軟骨組織工程移植重建創(chuàng)傷或疾病引起的關節(jié)表面大面積缺損的可能性。此外，在培養(yǎng)基中添加轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β3和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-6也可促進蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達。然而，相對骨髓來源干細胞，脂肪間充質(zhì)干細胞成軟骨分化能力較低，所產(chǎn)生的胞外基質(zhì)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白少［9］。

3 滑膜間充質(zhì)干細胞

至2001年成功分離出滑膜間充質(zhì)干細胞（SMSC）以來，大量研究證實SMSC可被誘導分化成多種類型細胞［10］。Yoshimura等［11］分離大鼠骨髓、滑膜、脂肪組織和肌肉來源間充質(zhì)干細胞，2次傳代后，SMSC的單克隆集落數(shù)比骨髓源干細胞的單克隆集落數(shù)高100倍；微團培養(yǎng)研究軟骨形成發(fā)現(xiàn)，與其他組織來源的間充質(zhì)干細胞相比，SMSC能產(chǎn)生更多的軟骨基質(zhì)，因此衍生的軟骨顆粒較重，表明SMSC較骨髓、脂肪組織和肌肉來源間充質(zhì)干細胞有更強的增殖和成軟骨能力。

Sekiya等［12］對10例股骨髁處軟骨損傷患者進行清創(chuàng)術，并將SMSC懸浮液注入軟骨缺損部位，術后52個月進行Lysholm評分，MRI和關節(jié)鏡檢查發(fā)現(xiàn)軟骨修復明顯改善。在此基礎上，Akgun等［13］將14例膝關節(jié)軟骨缺損患者隨機分為2組，分別植入SMSC和軟骨細胞，術后2年進行膝關節(jié)損傷和骨關節(jié)炎評分（KOOS）、疼痛視覺模擬評分（VAS）分析，發(fā)現(xiàn)植入SMSC修復效果較植入軟骨細胞好。此外，Koizumi等［14］分離OA和風濕性關節(jié)炎患者SMSC，發(fā)現(xiàn)SMSC是組織工程化軟骨修復有效的細胞來源。

4 軟骨膜干細胞

軟骨膜是關節(jié)面、肋軟骨、氣管、耳廓、椎間盤等處軟骨表面的一層結(jié)締組織［15］。軟骨膜分為2層，其內(nèi)層較疏松，富含細胞、神經(jīng)及小血管，外層纖維較致密，主要起保護作用。

Duynstee等［16］手術分離新西蘭大白兔耳廓軟骨膜的內(nèi)外層，通過創(chuàng)傷愈合模型來研究軟骨膜內(nèi)外層的作用，體外培養(yǎng)0、3、7、14和21 d后，免疫組化檢測Ki-67、Ⅱ型膠原、TGF-β1和成纖維細胞生長因子（FGF）-2表達，發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng)第3天開始創(chuàng)傷切邊上長出纖維細胞，但沒有新的軟骨形成；分離去軟骨的外層軟骨膜，培養(yǎng)21 d后可觀察到整個軟骨周圍有新的軟骨形成；同時分離去軟骨的內(nèi)外層軟骨膜，培養(yǎng)21 d后傷口表面未見任何改變。該體外實驗結(jié)果表明軟骨膜在軟骨傷口愈合中起雙重作用：一方面，緊貼軟骨處的軟骨內(nèi)膜可增殖分化為軟骨細胞；另一方面，軟骨外膜迅速向外產(chǎn)生致密纖維，以維持機械功能。

Kobayashi等［17］采用Ⅱ型膠原酶消化及貼壁培養(yǎng)法分離得到一群形態(tài)偏長，類似成纖維細胞的軟骨膜干細胞（PSC），流式分析發(fā)現(xiàn)PSC高表達間充質(zhì)干細胞標志物CD44和CD90，認為PSC在軟骨誘導條件下能增殖分化為軟骨細胞，并分泌大量胞外基質(zhì)；皮下注射PSC能形成＞2 cm的彈性軟骨，重建組織由軟骨和軟骨膜組成，即使10個月后仍然沒有任何異位組織形成，進一步確認軟骨膜中存在軟骨干／祖細胞。

5 關節(jié)軟骨表層干細胞

成熟的關節(jié)軟骨包括表層、中層（移行層）、深層（放射層）及鈣化軟骨層。表層軟骨細胞主要分泌蛋白聚糖4（PRG4），又稱潤滑素，起到關節(jié)潤滑作用［18］。Kozhemyakina 等［19］構(gòu) 建 Prg4GFPCreERt2∶Rosa26floxlacZ轉(zhuǎn)基因小鼠示蹤不同年齡階段Prg4陽性細胞在關節(jié)軟骨的表達情況，發(fā)現(xiàn)胚胎期17.5 d（E17.5）標記的Prg4陽性細胞（注射他莫昔芬后，lacZ染色呈藍色）在關節(jié)軟骨表層區(qū)域，成年小鼠中Prg4陽性細胞的子代細胞存在于所有關節(jié)軟骨層，以柱狀克隆形式從關節(jié)淺表區(qū)到潮線下鈣化軟骨；1月齡標記的Prg4陽性細胞（注射他莫昔芬后，lacZ染色呈藍色）的子代細胞從關節(jié)淺表層延伸到關節(jié)軟骨的2／3區(qū)域。這表明關節(jié)軟骨細胞深處及潮線以下被標記為Prg4陽性的細胞是E17.5標記為Prg4陽性細胞的子代細胞，而不是1月齡被標記的Prg4陽性細胞的子代細胞。Li等［20］利用 H2BGFP和Prg4-CreErt∶Confetti小鼠研究關節(jié)軟骨表層干細胞（ACSC），發(fā)現(xiàn)表層細胞具有增殖活性，但分裂能力較低；Prg4陽性細胞可沿著關節(jié)表面對稱分裂，子細胞均留在表層，也可垂直于關節(jié)表面非對稱分裂，1個子細胞留在表面，另1個向下分化為更深層的軟骨細胞，進一步提示這群細胞具有干細胞特性。該研究團隊進一步分離這群細胞，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞表面標志物為陽性，且具有體外克隆形成能力和成軟骨、成骨及成脂分化能力。

關節(jié)軟骨表層細胞具有獨特的結(jié)構(gòu)和生物力學特征，關節(jié)軟骨自我修復能力差可能與ACSC丟失有關［21-22］。Jia等［23］研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體（EGFR）信號通路在維持ACSC數(shù)目中發(fā)揮重要作用，EGFR敲除小鼠ACSC數(shù)目明顯減少，關節(jié)軟骨退變加快。體外分化實驗證實，ACSC能分化為軟骨細胞，且可以遷移至軟骨損傷部位進行軟骨修復［24］，但具體機制尚不清楚。Yasuhara等［25］采用纖連蛋白黏附法從新生小鼠關節(jié)軟骨分離ACSC并進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比軟骨細胞在低密度培養(yǎng)時呈規(guī)則的多邊形及融合時呈鋪路石樣的形態(tài)特性，經(jīng)纖連蛋白黏附法分選出的ACSC形態(tài)偏長，類似成纖維細胞；逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測顯示，ACSC分化的軟骨細胞顯著低水平表達間充質(zhì)干細胞標志物CD73、CD90、CD105和軟骨表層標志物Prg4、Erg、Ten C，但顯著高水平表達軟骨細胞標志物Col2、Acan、Mat-1。Tong等［26］研究證實，在正常關節(jié)和OA關節(jié)軟骨表層存在ACSC。OA早期，ACSC激活并通過增殖反應展現(xiàn)自我修復能力；體外實驗顯示，白細胞介素（IL）-1β通過激活核因子（NF）-κB顯著抑制 ACSC的軟骨形成能力，而抑制NF-κB信號通路可促進ACSC軟骨形成；SD大鼠OA模型實驗證實，抑制NF-κB信號通路可激活ACSC，從而促進軟骨再生，證明誘導內(nèi)源性干／祖細胞用于關節(jié)軟骨修復和OA治療的可行性。

顳下頜關節(jié)是一種特殊的軟骨組織，與膝關節(jié)透明軟骨不同，屬于纖維軟骨。2016年，Embree等［27］從顳下頜關節(jié)髁突表層分離細胞進行體內(nèi)異種移植，發(fā)現(xiàn)該群細胞不僅能形成軟骨和骨，也能形成造血微環(huán)境，首次證明顳下頜關節(jié)髁突表層存在纖維軟骨干細胞；進一步研究發(fā)現(xiàn)，降低 Wnt信號可以顯著減少大鼠顳下頜ACSC，進而導致關節(jié)軟骨退變和OA發(fā)生。

6 結(jié)語

作為軟骨組織工程必要因素之一的種子細胞，關節(jié)軟骨干／祖細胞數(shù)量有限，需要體外擴增獲得一定數(shù)量后予以應用。大量研究或通過在培養(yǎng)基中添加TGF-β、BMP等促進蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白表達，或利用成熟軟骨細胞形成的共培養(yǎng)微環(huán)境、干細胞分泌的細胞因子促進細胞增殖和基質(zhì)合成。反之，細胞因子又可誘導干細胞分化，防止體外培養(yǎng)條件下軟骨細胞去分化［28-30］。然而，對傳代30次的軟骨干細胞進行細胞生物學分析，發(fā)現(xiàn)有1／6的細胞克隆顯示出異常核型［31］，提示軟骨干細胞在進行臨床治療前應對生物安全性進行多方面驗證。隨著研究的深入，對關節(jié)軟骨干／祖細胞的了解將更加全面和深刻，相信在不久的將來，關節(jié)軟骨干／祖細胞將被廣泛應用于軟骨組織工程移植重建創(chuàng)傷或疾病引起的關節(jié)表面大面積缺損。