可注射型磷酸鎂骨水泥生物相容性及體外模型中性能表現(xiàn)的評價

陶春杰 余鈴 郭良煜 陳敬騰 方碩 郭衛(wèi)春

椎體壓縮性骨折是臨床常見的脊椎損傷，對于后壁完整者，經(jīng)皮椎體后凸成形術(shù)（PKP）是現(xiàn)行的良好治療方法［1-2］。然而PKP可在椎體內(nèi)形成較大骨缺損，目前最常使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥作為骨替代物填充缺損。但是，PMMA不可生物降解，植入后將永久存在。由于其機械性能與自體骨存在差異［3］，且為生物惰性材料，不具備骨誘導(dǎo)和骨引導(dǎo)的特性。注入的PMMA骨水泥固化后結(jié)構(gòu)致密，不僅無法被自體骨整合，也妨礙損傷處自體骨的長入修復(fù)，導(dǎo)致骨替代物相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生［4-5］。另外，制備 PMMA 所使用的單體有毒［6］，且在其進入體內(nèi)后的固化過程中迅速大量放熱致局部溫度驟升，這些因素均可損傷周圍組織，不利于自體骨組織修復(fù)。

鑒于上述原因，尋找一種力學(xué)性能優(yōu)越且具有良好的生物降解性和骨誘導(dǎo)、骨引導(dǎo)性能的PKP骨填充材料是研究者們長期以來的目標(biāo)。

磷酸鎂骨水泥（MPC）是一種新型無機骨修復(fù)材料［7］，其機械性能、生物相容性、生物降解性及生物活性良好，可注射性好，固化放熱少。有研究表明，MPC作為骨替代物植入骨缺損后可逐步降解，同時可誘導(dǎo)自體骨組織修復(fù)缺損，最終達到缺損部位理想的完全自體骨修復(fù)［8］。

綜合分析后我們認(rèn)為，MPC作為PMMA的替代物應(yīng)用于PKP中治療椎體壓縮性骨折具有極大潛能。因此，本研究擬通過在體外羊椎體PKP模型中使用 MPC，并測定其強化能力，來探索MPC在PKP中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

主要試劑：氧化鎂（Mg O），磷酸二氫鉀（KH2PO4）及磷酸三鈣［Ca3（PO4）2］均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；PMMA骨水泥為某品牌商品化醫(yī)用骨水泥。

主要儀器：行星式球磨儀（F-P400，湖南弗卡斯公司），萬能試驗機（深圳市瑞格爾儀器有限公司），微CT掃描儀（SkyScan 1176，德國布魯克公司），掃描電鏡（VEGA 3 LMU，德國VEGA公司）。

實驗動物：新生雄性SD大鼠3只，3月齡雄性新西蘭白兔12只（體質(zhì)量3.0～3.4 kg），均購自湖北省實驗動物研究中心；12只骨成熟山羊的L4～6椎骨，共36個，購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

動物實驗已獲得武漢大學(xué)實驗動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 MPC制備

本研究使用的MPC材料為研究組自主合成，合成原理參照已有文獻報道［7］，概述如下：依據(jù)MPC的反應(yīng)原理MgO＋HPO42－＋H2O→MgPO4－＋OH－＋H2O，使用 MgO、KH2PO4、Ca3（PO4）2球磨后過200目篩所得粉末為固相，并添加緩凝劑、離子螯合劑以延緩中和反應(yīng)速率及提高材料強度，以雙蒸水為液相，合成本實驗所用MPC配方。

1.3 體外細胞實驗

取新生SD大鼠顱骨，PBS清洗表面后剪碎成1～2 mm碎屑，置于1%Ⅰ型膠原酶中消化1 h，1 200 r／min離心，PBS洗滌沉淀，轉(zhuǎn)入1%EDTA胰酶中消化30 min。消化后再次離心、洗滌，得到的沉淀液用含12% 胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸，并用25 cm2培養(yǎng)瓶在37℃、5%二氧化碳（CO2）、100%相對濕度下培養(yǎng)。48 h后首次換液，棄去瓶中殘留的少量骨屑，得到幼鼠原代成骨細胞。

MPC及PMMA骨水泥調(diào)制成可注射漿料后預(yù)成型為直徑6 mm、高度3 mm的圓盤，在37℃、100%相對濕度下固化24 h后放入培養(yǎng)皿中。取原代成骨細胞消化重懸為細胞密度5×104個／m L的單細胞懸液，接種于圓盤上表面，在5%CO2、37℃、100%相對濕度下孵育。接種后分別于4、24 h以2%戊二醛固定，將固定后的骨水泥-細胞樣本制樣，以掃描電鏡觀察材料表面的形態(tài)學(xué)及細胞黏附生長情況。

1.4 MPC抗壓強度及可注射性測定

將MPC制成直徑6 mm、高12 mm的圓柱體，使用萬能試驗機測定其抗壓強度。測試時加載速度為1 mm／min，載荷降低到50%最大載荷以下時終止實驗。

可注射性測定：取50 m L注射器稱取質(zhì)量，記為M1；將MPC粉末加液相調(diào)配成膏體后裝入注射器內(nèi)稱取質(zhì)量，記為M2；推注注射器，待活塞無法推進后再次稱取質(zhì)量，記為M3；MPC可注射性計算公式為

每組實驗獨立重復(fù)3次取平均值。

1.5 體外PKP造模及修復(fù)實驗

將36個骨成熟山羊的L4～6椎骨隨機均分為A、B、C 3組。A組椎骨不予處理，作為陽性對照組。對B組及C組椎骨依據(jù)文獻報道方法行PKP造模［9］，方法如下：用直徑4 mm手鉆沿雙側(cè)對位椎弓根入路鉆入椎體中央，不鉆破椎體前方皮質(zhì)骨，鉆頭與經(jīng)過椎體縱軸的椎骨矢狀面呈30°～50°，與椎體底面所在水平面上下均呈0°～30°，構(gòu)成椎體內(nèi)“V”型缺損。造模后，C組椎骨經(jīng)鉆孔入路注入MPC填滿缺損，然后將其置于37℃、100%相對濕度下保存，等待材料固化；B組椎骨不填充MPC，作為空白對照組。于PKP造模術(shù)后2、24、48、72 h分別取A、B、C 3組椎骨，用萬能試驗機測定椎體的軸向最大載荷。測定時，去除椎弓根及其后結(jié)構(gòu)，銑刀處理椎體上下端使椎體的上下底面平行，處理過程中注意不過多磨損骨皮質(zhì)。實驗中加載速度為1 mm／min，載荷降低到50%最大載荷以下時終止試驗。見圖1。

圖1 軸向最大載荷測試前及測試中的體外羊椎體

1.6 動物實驗

將12只新西蘭白兔隨機均分為4組，依據(jù)已有文獻方法行雙側(cè)兔股骨髁缺損造模［10］，方法如下：戊巴比妥鈉麻醉后切開兔股骨外側(cè)髁，電鉆造直徑6 mm、高12 mm的骨缺損，左、右側(cè)股骨髁缺損分別以MPC和PMMA骨水泥膏體填充后縫合，材料在體內(nèi)原位固化。于術(shù)后1、3、6、12周分別取1組實驗動物，取雙側(cè)股骨行微CT掃描，觀察骨缺損修復(fù)情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用方差分析（ANOVA）及t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MPC和PMMA骨水泥的細胞黏附情況

在MPC和PMMA骨水泥表面接種細胞并培養(yǎng)后以掃描電鏡觀察顯示：細胞接種4 h時，MPC表面已出現(xiàn)大量黏附細胞，PMMA骨水泥表面幾乎無黏附細胞；24 h時，MPC表面黏附的細胞伸出偽足，伸展良好，PMMA骨水泥表面的細胞黏附情況與4 h時無明顯差異。見圖2。

圖2 掃描電鏡觀察不同修復(fù)材料的細胞黏附情況（×1 000倍）（箭頭所指為黏附于材料表面的細胞）

2.2 MPC的抗壓強度和可注射性

抗壓強度測定顯示，MPC固化后抗壓強度為（30.16±1.22）MPa，滿足骨替代物所需的抗壓強度?？勺⑸湫詼y定顯示，MPC固化前的可注射性η為99.69%±0.32%。

2.3 羊椎體骨體外實驗結(jié)果

A、B、C組椎體骨軸向可承受最大載荷測定顯示：A、B組各時間點間最大載荷無差異（F＝0.052，P＝0.983；F＝0.002，P＝0.999）；與 A組相比，B、C組椎體各時間點的最大載荷均顯著降低；MPC注入后2、24、48、72 h，C組椎體最大載荷均顯著高于B組（P＜0.05），椎體得到強化；C組椎體各時間點的最大載荷存在差異（F＝26.16，P＜0.05），24 h時最大載荷高于2 h時（t＝4.338，P＜0.05），而24 h與48 h、48 h與72 h時最大載荷無差異（t＝1.588，P＝0.239；t＝5.740×10ˉ6，P＞0.999），表明 MPC對椎體強化的形成主要發(fā)生在注入后24 h內(nèi)。見表1。

表1 3組椎體不同時間點軸向最大載荷（k N）

2.4 動物實驗結(jié)果

動物實驗術(shù)后1、3、6、12周時微CT檢查顯示（圖3）：MPC和PMMA骨水泥修復(fù)處的周圍骨質(zhì)均未發(fā)生明顯炎癥、骨折、骨質(zhì)吸收；各時間點PMMA均未降解，12周時，MPC出現(xiàn)降解征象，且周圍可見少量新骨形成，新骨與殘余材料之間骨整合良好。

圖3 兔股骨髁缺損模型中骨替代材料植入1、3、6、12周后的微CT掃描結(jié)果

3 討論

本實驗系統(tǒng)性評價了MPC的細胞相容性、生物體內(nèi)相容性和體外椎體模型中的機械性能表現(xiàn)。

正常脊柱承受的載荷主要沿其縱軸分布，椎體壓縮性骨折正是由于軸向載荷過大或椎體本身病變導(dǎo)致的椎體結(jié)構(gòu)破壞［11］。PKP是目前治療椎體壓縮性骨折最常用的手術(shù)方式。PMMA是臨床最常用的PKP骨替代物，但其生物活性差，在人體內(nèi)難以達成理想的植入物-細胞響應(yīng)，無法進一步提高治療效果，并可發(fā)生并發(fā)癥。本研究中，我們將大鼠成骨細胞接種于PMMA表面，4 h時初步黏附的細胞顯著少于接種于MPC者；接種24 h后，PMMA表面黏附的細胞不僅數(shù)量遠少于MPC，且細胞形態(tài)差，在PMMA表面無法伸展。該現(xiàn)象的發(fā)生可能與細胞黏附機制有關(guān)［12］，即PMMA材料表面過于光滑致密，妨礙表面蛋白等物質(zhì)的吸附，導(dǎo)致細胞黏附、增殖活動受阻。

MPC是一種新型骨水泥材料，具有良好的生物相容性、生物降解性和機械特性等，近年受到研究者的廣泛重視［13-14］。材料學(xué)實驗證實，MPC固化后強度達（30.16±1.22）MPa，且固化過程中可注射性達100%，可滿足PKP手術(shù)的基本要求。本研究中，將大鼠成骨細胞接種于MPC，4 h后即有大量細胞黏附于MPC表面，24 h時黏附細胞進一步增多，且細胞伸展良好。研究結(jié)果表明，MPC具有良好的與成骨細胞發(fā)生材料-細胞響應(yīng)的能力，也證實MPC的細胞相容性優(yōu)越。

國內(nèi)文獻報道，將MPC作為粘接劑用于脛骨骨折模型取得滿意效果［15］，證實MPC在固定骨折中具有良好的機械性能。在此基礎(chǔ)上，本研究探究了MPC在PKP模型中的機械性能。山羊椎體在解剖上近似人類椎體，是脊柱研究實驗的常用選材，因此我們采用山羊椎體進行PKP造模后填充MPC，通過最大載荷測試評價MPC的機械性能。研究顯示，未置入骨替代物時PKP椎體模型軸向最大載荷較正常椎體顯著下降（該結(jié)果符合實際病理狀況）；注入MPC后2 h（模擬臨床工作中PKP結(jié)束時刻）椎體的軸向最大載荷顯著大于未注入MPC填充缺損的對照組，注入后24 h時椎體的軸向最大載荷趨向于正常椎體的最大載荷變化，注入48 h及之后椎體的軸向最大載荷已穩(wěn)定于固化后最大值。該實驗結(jié)果表明，MPC提高了缺損椎體的軸向最大載荷，使之恢復(fù)到接近正常椎體的軸向載荷。

綜上，本研究證實，MPC是一種細胞相容性和機械穩(wěn)定性良好的骨修復(fù)材料，具有代替PMMA應(yīng)用于PKP的巨大潛能。但由于體外模型是對于機體真實病理狀態(tài)的簡化模擬，以MPC替代PMMA的體內(nèi)PKP面臨的情況更加復(fù)雜，且MPC植入后將面臨長期骨修復(fù)過程中與機體發(fā)生的動態(tài)相互作用，因此其實用性仍需開展進一步的研究來探索。