基于RSM模型的堿性磷酸酶參考方法測(cè)量條件研究

劉春龍 錢(qián) 全 王 勇 李申龍 徐元勇△

近年來(lái)國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)(JCTLM)和衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心一直致力于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化研究,希望能夠?qū)崿F(xiàn)不同醫(yī)院檢驗(yàn)結(jié)果的互認(rèn)和統(tǒng)一[1]。但酶的測(cè)定結(jié)果往往非常混亂,同一標(biāo)本在不同實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)結(jié)果 相差很大[2]。國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟(IFCC)在1986年完成了堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的推薦參考方法[3]。由于酶學(xué)參考測(cè)量存在諸多的影響因子,ALP參考方法的測(cè)量條件需要由參考實(shí)驗(yàn)室在不違背參考方法既定要求的前提下進(jìn)行優(yōu)化。考慮響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)不僅考慮各種影響因子對(duì)測(cè)量曲線的線性影響,也同時(shí)考慮不同因子間的交互影響和曲率影響[4]。本文基于RSM模型研究ALP參考方法的測(cè)量條件,現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

(1)樣本

收集北京航天總醫(yī)院檢驗(yàn)科血清樣本,考慮溶血、黃疸、乳糜樣本會(huì)影響正確度驗(yàn)證結(jié)果[5],本研究通過(guò)檢驗(yàn)報(bào)告結(jié)果及肉眼觀察,剔除溶血、黃疸、乳糜的樣本,根據(jù)常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果將血清進(jìn)行混合,制備成符合所需濃度范圍要求的混合血清。以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心處理,用0.2μm濾膜過(guò)濾后,分裝凍存于-80℃低溫冰箱。

ALP參考物質(zhì)選用日本臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)的CRM-001c(靶值為425U/L,擴(kuò)展不確定度為3.06%,k=2)。

(2)主要儀器

Cary-100紫外、可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司)、XSE205十萬(wàn)分位電子天平(瑞士梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司)、MICROLAB500稀釋配液儀(瑞士哈密爾頓公司)、HH-4恒溫水浴箱(中國(guó)國(guó)華電器有限公司)、F1523手持式鉑電阻溫度計(jì)(美國(guó)福祿克電子儀器儀表公司)。

(3)主要試劑

N-β-羥基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA,批號(hào)MKBD2551)、七水硫酸鋅(批號(hào)62150)、醋酸鎂(批號(hào)40680),購(gòu)自美國(guó)西格瑪公司;2-氨基-2甲基-1-丙醇(AMP,批號(hào)130517A)、磷酸對(duì)硝基苯酚(4-NPP,批號(hào)130708A),購(gòu)自中國(guó)阿匹斯公司。

2.方法

(1)單因素實(shí)驗(yàn)

結(jié)合ALP項(xiàng)目參考測(cè)量原理,初步確定影響因子[6]。繪制不同影響因子與酶催化活性濃度測(cè)量結(jié)果的趨勢(shì)關(guān)系圖,確定各影響因子是否為重要影響因子,并觀察趨勢(shì)圖是否包含最高值[7],以判斷是否能確定RSM實(shí)驗(yàn)區(qū)域。

(2)RSM實(shí)驗(yàn)

按單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定三個(gè)重要影響因子及實(shí)驗(yàn)區(qū)域,實(shí)驗(yàn)區(qū)域包括高、中、低三個(gè)濃度水平(三因子三水平)。采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并按設(shè)計(jì)方案配制試劑,測(cè)量相同混合血清樣本;繪制不同影響因子與測(cè)量結(jié)果的等值線圖和響應(yīng)曲面圖。

(3)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

測(cè)量ALP參考物質(zhì)CRM-001c,若測(cè)量結(jié)果符合其測(cè)量不確定度要求,則驗(yàn)證通過(guò)。

(4)統(tǒng)計(jì)分析方法

①單因素實(shí)驗(yàn)采用Minitab 16軟件進(jìn)行單因素方差分析,判斷影響因子對(duì)ALP催化活性濃度的影響在不同濃度組間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②RSM實(shí)驗(yàn)采用Minitab16軟件先分別進(jìn)行RSM圖形分析(等值線圖與曲面圖)、RSM模型顯著性分析、RSM模型方差分析、測(cè)量結(jié)果回歸系數(shù)估計(jì),建立模型方程式后再使用優(yōu)化器功能確定最佳測(cè)量條件。③計(jì)算正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果與參考物質(zhì)靶值的相對(duì)偏移,再判斷其是否符合參考物質(zhì)的測(cè)量不確定度要求。

結(jié) 果

1.單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

影響因子不同水平設(shè)計(jì),見(jiàn)表1。

2.單因素分析

進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果表明反應(yīng)液pH值、4-NPP濃度、AMP濃度三個(gè)因子對(duì)ALP酶催化活性濃度的影響在不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.14×10-9<0.01),因此所選定的三個(gè)影響因子均為重要影響因子。繪制趨勢(shì)圖(圖1),可見(jiàn)單因素實(shí)驗(yàn)所確定實(shí)驗(yàn)區(qū)域可包括ALP最高催化活性。因此可將水平3設(shè)置為RSM設(shè)計(jì)中心點(diǎn)[8]。

表1 影響因子不同水平設(shè)計(jì)

圖1 影響因子與其催化活性濃度結(jié)果的趨勢(shì)圖

3.RSM實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)Box-Behnken設(shè)計(jì)及催化活性濃度測(cè)量結(jié)果,見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)測(cè)量結(jié)果

(2)ALP項(xiàng)目RSM圖形分析,見(jiàn)圖2～圖4。

從圖形可以看出,ALP測(cè)量結(jié)果與各影響因子間都存在響應(yīng)曲面,4-NPP濃度和AMP濃度與測(cè)量結(jié)果的等值線圖軸線與坐標(biāo)軸存在明顯的角度,說(shuō)明4-NPP濃度和AMP濃度之間存在明顯的交互作用,其他影響因子之間不存在交互作用。另外,pH值均處于等值線橢圓形的短徑處,即測(cè)量結(jié)果的變化對(duì)pH值最為敏感。在ALP試劑配制時(shí),應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)液pH值。

(3)RSM模型方差分析,見(jiàn)表3。結(jié)果顯示所有重要影響因子對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),模型擬合效果良好(失擬項(xiàng)P>0.05),模型R2=94.36%和調(diào)整R2=95.99%,表明模型擬合效果良好。

表3 RSM模型方差分析

(4)測(cè)量結(jié)果回歸系數(shù)估計(jì),見(jiàn)表4。

分別用Y表示ALP測(cè)量結(jié)果,A表示反應(yīng)液pH值,B表示4-NPP濃度,C表示AMP濃度。

ALP各影響因子的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)ALP測(cè)量結(jié)果均存在顯著影響(P<0.01),4-NPP濃度和AMP濃度之間存在顯著交互作用(P<0.05),其他影響因子之間不存在明顯交互作用(P>0.05)。

圖2 ALP測(cè)量結(jié)果與4-NPP濃度,pH值的等值線圖和曲面圖

圖3 ALP測(cè)量結(jié)果與AMP濃度,pH值的等值線圖和曲面圖

圖4 ALP測(cè)量結(jié)果與AMP濃度,4-NPP濃度的等值線圖和曲面圖

表4 測(cè)量結(jié)果的回歸系數(shù)估計(jì)

(5)測(cè)量條件優(yōu)化

使用Minitab 16軟件中的RSM模型優(yōu)化器功能,選擇“望大”分析,即選擇混合血清測(cè)值最高時(shí)的測(cè)量條件。預(yù)測(cè)結(jié)果復(fù)合合意性均大于0.99,預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5,[]內(nèi)數(shù)字表示預(yù)測(cè)最佳測(cè)量條件,即ALP理論最佳測(cè)量條件為反應(yīng)液pH值10.24、4-NPP濃度15.83mmol/L、AMP濃度747.28mmol/L。

(6)正確度驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 正確度驗(yàn)證結(jié)果

討 論

檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化和一致化研究,是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門(mén)話題,國(guó)內(nèi)于2012年已初步建立了國(guó)家酶學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)[9]。目前市場(chǎng)上ALP項(xiàng)目的測(cè)量結(jié)果與參考方法測(cè)量結(jié)果相對(duì)偏移可達(dá)8%～10%[10]。在ALP參考方法運(yùn)行的過(guò)程中,必須對(duì)測(cè)量條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化,以期找到最佳測(cè)量條件組合。傳統(tǒng)的單因素法篩選出來(lái)的測(cè)量條件之間往往會(huì)存在一定的交互作用,實(shí)驗(yàn)量很大且不能得到滿意的結(jié)果。而RSM是一種多因素分析方法,能夠很好地反應(yīng)測(cè)量條件之間的交互作用,且能通過(guò)選擇合理的設(shè)計(jì)方式,大幅度減少實(shí)驗(yàn)次數(shù),有效彌補(bǔ)單因素法的不足[4]。本研究并未完全摒棄傳統(tǒng)的單因素法,而是將其用于重要影響因子和RSM實(shí)驗(yàn)區(qū)域的確認(rèn),創(chuàng)新性地將傳統(tǒng)的單因素法與RSM聯(lián)合起來(lái),獲得了良好的效果。

單因素分析的結(jié)果表明反應(yīng)液pH值、4-NPP濃度、AMP濃度為ALP項(xiàng)目的重要影響因子。分析ALP重要影響因子與催化活性濃度測(cè)量結(jié)果的趨勢(shì)圖,發(fā)現(xiàn)單因素分析結(jié)果均包括了測(cè)量結(jié)果最高值,因此,將中等水平即水平3設(shè)置為RSM設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。RSM常用的三種設(shè)計(jì)方式中,3k因子設(shè)計(jì)由于實(shí)驗(yàn)次數(shù)較多,一般較少使用,常用Box-Behnken設(shè)計(jì)或CCD設(shè)計(jì)[12]。在本研究中,根據(jù)酶學(xué)測(cè)量的報(bào)道[7],考慮其響應(yīng)曲面是存在的,Box-Behnken設(shè)計(jì)可對(duì)一階或二階系數(shù)提供更好的估計(jì),因此選擇Box-Behnken設(shè)計(jì)。按Box-Behnken設(shè)計(jì)方案組合安排實(shí)驗(yàn),以測(cè)量結(jié)果作為RSM的響應(yīng)值建立模型并繪制等值線圖和響應(yīng)面圖,證明曲面確實(shí)存在,且包含最佳測(cè)量條件。對(duì)所建立的RSM模型的性能評(píng)價(jià),主要考慮了模型的擬合度和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。RSM模型的評(píng)價(jià)結(jié)果表明,所有重要影響因子對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),模型擬合效果良好(失擬項(xiàng)P>0.05),模型預(yù)測(cè)效果良好。各影響因子的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)ALP催化活性濃度測(cè)量結(jié)果存在顯著影響(P<0.01)[7]。其中,4-NPP濃度和AMP濃度之間存在顯著交互作用(P<0.05),其他影響因子之間不存在明顯交互作用(P>0.05)。交互作用的分析結(jié)果與RSM等值線圖分析結(jié)果一致。通過(guò)Minitab16軟件優(yōu)化器功能,獲得了ALP最佳理論實(shí)驗(yàn)條件,并通過(guò)了正確度驗(yàn)證。正確度驗(yàn)證結(jié)果表明,驗(yàn)證結(jié)果與CRM靶值相對(duì)偏移能滿足其測(cè)量不確定度的要求。另外,通過(guò)RSM圖形分析發(fā)現(xiàn),反應(yīng)液pH值對(duì)ALP催化活性濃度測(cè)量結(jié)果影響較大,在試劑配制過(guò)程中,應(yīng)嚴(yán)格控制。

本研究成功將RSM模型應(yīng)用于ALP參考方法測(cè)量條件的研究,獲得良好的效果,探索了不同影響因子與參考測(cè)量結(jié)果的關(guān)聯(lián)性及影響因子之間的交互作用,進(jìn)而為ALP檢驗(yàn)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)化提供了科學(xué)依據(jù)。