真姬菇生產(chǎn)廢料不同溶劑提取物抗氧化活性研究

李佳歡，都新榮，王若瑾，金文松，胡開輝*

(1.福建農(nóng)林大學 生命科學學院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(古田) 菌業(yè)研究院，福建 寧德 352200)

真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)，又名海鮮菇、白玉菇、蟹味菇等，味道鮮美，口感脆嫩，廣受亞洲人們喜愛[1,2]。隨著種植規(guī)模的不斷擴大，現(xiàn)今真姬菇已經(jīng)成為國內(nèi)食用菌工廠化栽培的重要品種之一。真姬菇采收后，經(jīng)切頭、分揀，挑選菇柄長度大于15 cm的成品菇進行包裝，整個流程會產(chǎn)生大量的生產(chǎn)廢料，即小菇、菇腳，占鮮菇重量的15%左右。其中，小菇的價格約為成品菇的30%，而菇腳大部分按垃圾處理，隨意丟棄不但造成資源的浪費，且易造成霉菌及其他有害微生物滋生，造成環(huán)境污染[3]。因此，若能將小菇和菇腳等廢渣“變廢為寶”，將對整個食用菌產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟價值和社會效益。

研究表明，真姬菇多糖具有抗氧化活性，濃度為5 mg/mL時，其清除能力與Vc基本相當[4]；與茶樹菇、松杉靈芝相比，真姬菇的抗氧化活力更高[5]。Lee等[6]指法，不同溶劑對真姬菇提取物的抗氧化活性有一定影響。于洪超等[7]在對真姬菇菌腳中營養(yǎng)成分和活性成分的研究中指出，真姬菇菌腳中多糖、黃酮、皂苷、總酚的含量均高于子實體。林群英等[8]在對真姬菇菇腳的研究中也發(fā)現(xiàn)真姬菇菇腳酶解產(chǎn)物可延長秀麗線蟲壽命，具有良好的抗氧化活性。

本文采用ABTS、DPPH及亞鐵還原能力測定方法對真姬菇成品菇、小菇及菇腳的水、甲醇、丙酮和正丁醇4種不同提取物進行體外抗氧化活性研究，并測定各種提取物中總酚的含量，進行相關(guān)性分析，為真姬菇菇腳、小菇的綜合開發(fā)利用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料：真姬菇菇腳、小菇、成品菇，購于福建福泉鑫生物科技有限公司。材料在實驗室于55 ℃烘干，經(jīng)粉碎后過60目篩，最后分別密封備用。

供試試劑：沒食子酸(純度≥99.0%)標準品，購于上海麥克林生化科技有限公司；ABTS(純度≥98.0%)、抗壞血酸、水溶性維生素E，購于北京Solarbio科技有限公司；DPPH(純度≥97.0%)，購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；甲醇、丙酮、正丁醇、無水乙醇、福林酚試劑、過硫酸鉀、磷酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等，購于國藥集團化學試劑有限公司，以上試劑未標注皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

低碳節(jié)能烘干房 龍巖市向榮制冷設(shè)備有限公司；HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱 蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司；HC-2000高速多功能粉碎機 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；WP-UP-III-20精密型超純水機 四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司；N-1300D-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、CA-1115A冷卻水循環(huán)泵、A-1000S水流抽氣機 埃朗科技(東京理化器械(株)獨資工廠)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；調(diào)速型迷你離心機 生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同溶劑提取物的制備

準確稱取30.0 g干燥的真姬菇、小菇、菇腳粉末置于三角瓶中，按固液比1∶10(g/mL)加入提取的溶劑于搖床中，在150 r/min，26 ℃條件下，提取12 h，過濾，得到濾液并減壓蒸餾回收溶劑(38～55 ℃)[9]，在溶劑體積約為10 mL時，得浸膏，用移液管吸出至平皿，于冷凍干燥機中揮干溶劑，稱重備用。采用同樣的方法，用水、甲醇、正丁醇和丙酮分別進行提取，分別得到物料的對應提取物，每組設(shè)置2個重復，計算提取率后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

精確稱取不同的溶劑提取物0.4 g溶解于10 mL DMSO中，利用超聲振蕩充分溶解配制成40 mg/mL的樣品母液于4 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 總酚含量的測定

參考Labuckas D O等[10]的方法對樣品中的總酚含量進行測定，采用福林-酚比色法(Folin-Ciocalteu)測定樣品中的總酚含量。以沒食子酸作為標品進行標準曲線的測定，根據(jù)沒食子酸濃度(X軸)與OD值(Y軸)繪制標準曲線，所得標準曲線的線性回歸方程為：Y=0.1041X-0.0356，R2=0.9992。

1.3.3 抗氧化能力測定

1.3.3.1 樣品稀釋方法

吸取不同溶劑提取物的母液，用DMSO稀釋成20，10，8，6，4，2，1，0.5 mg/L的樣品溶液備用。

1.3.3.2 ABTS自由基清除活性測定

配制7 mmol/L的ABTS和4.9 mmol/L的K2S2O8(過硫酸鉀)作為儲備液，測定時取ABTS儲備液和 K2S2O8儲備液各10 mL，混勻后于黑暗中放置12～16 h，然后用無水乙醇在734 nm下較準OD值至0.700±0.003，配制成ABTS工作液[11]。加入20 μL不同濃度(0.5～10 mg/mL)的樣品溶液在96孔板中，再加入180 μL ABTS工作液，震蕩搖勻，避光放置30 min，將96孔板放入酶標儀中在734 nm下測得樣品的吸光度(As)。用10 μL DMSO代替樣品溶液測得空白吸光度(Ac)；用無水乙醇代替ABTS混合液測得樣品本底吸光度(Aj)；不同濃度分別做3個平行，取其平均值，以Vc做陽性對照，清除率計算公式為：

(1)

最后根據(jù)計算出的清除率算出EC50值。

1.3.3.3 DPPH清除自由基能力

用無水乙醇作為溶劑溶解DPPH配制成0.4 mmol/L的溶液，置于棕色瓶中放于陰涼處儲藏備用。在96孔板中加入100 μL不同濃度的樣品溶液和100 μL 0.2 mmol/L的DPPH。加樣完成后置于室溫下避光振蕩30 min，待充分反應在 517 nm 波長處測得樣品的吸光度(As) ；用20 μL DMSO代替體系中的樣品溶液測得空白吸光度(Ac) ；用無水乙醇代替體系中的 DPPH溶液測得樣品本底吸光度(Aj) ；每種樣品的每個濃度分別做3個平行，計算其平均值。以 Vc做陽性對照，按公式(1)計算出其清除率[12]。

1.3.3.4 還原能力測定

取20 μL稀釋后不同濃度的DMSO樣品溶液于離心管中，再依次加入50 μL磷酸鈉緩沖液(0.2 mmol/L，pH 6.6)和50 μL 1% 的K3Fe(CN)6(W/V)，50 ℃水浴20 min后，加入20 μL 10%的三氯乙酸終止反應，隨后于12000 r/min下離心3 min[13]。取100 μL離心后的上清液和100 μL去離子水充分混合，加入20 μL的0.1% FeCl3，室溫孵育15 min，700 nm下測定樣品吸光度，吸光值越大，還原力越強。以20 μL DMSO代替樣品作為空白，以Vc作為陽性對照，平行測定3次。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5和SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對菇腳、小菇、成品菇提取率的影響

不同溶劑對真姬菇菇腳、小菇、成品菇提取率的影響見表1。經(jīng)不同溶劑提取后，菇腳、小菇、成品菇中不同極性的物質(zhì)在4種有機萃取劑中的分布趨勢保持一致，萃取率為：水萃取物>甲醇萃取物>正丁醇萃取物>丙酮萃取物。根據(jù)相似相溶原理，推斷樣品中的物質(zhì)成分親水性較強，易溶解于水。通過對比菇腳、小菇、成品菇不同萃取物的得率可以發(fā)現(xiàn)，水與甲醇的萃取率呈現(xiàn)出成品菇>小菇>菇腳，其中菇腳與成品菇差異顯著(P<0.01)；而正丁醇提取物的萃取率，菇腳與成品菇差異并不顯著，但兩者顯著高于小菇得率(P<0.05)。結(jié)果說明真姬菇菇腳中小極性物質(zhì)的含量與成品菇相似。

表1 不同溶劑萃取物的提取率Table 1 The extraction rates of various solvent extracts

2.2 真姬菇不同溶劑提取物中總酚含量的測定

真姬菇所含的抗氧化成分中主要是酚類化合物，它們具有良好的抗氧化活性，并且能夠與維生素和胡蘿卜素等其他抗氧化有效成分同時作用于人體，一起發(fā)揮抗氧化功能，有效地清除機體中多種有害的自由基[14]。因此，近年來酚類化合物對人體健康產(chǎn)生的重要影響也受到越來越多研究人員的關(guān)注。

表2 不同溶劑提取物的總酚含量Table 2 Total phenol content of various solvent extracts

因為真姬菇中的酚類物質(zhì)在不同溶劑中具有不同的溶解度，由表2可知，真姬菇菇腳、小菇、成品菇的水提物中總酚的含量最高，分別為1.146，1.447，1.458 mg/g，其次是甲醇、丙酮和正丁醇，隨著溶劑極性的減小，總酚得率越來越小，導致這種現(xiàn)象的原因可能是真姬菇總酚的極性較大，親水性強，易溶解于水。另外，真姬菇成品菇的總酚含量在各溶劑提取物中普遍高于菇腳和小菇，這與各溶劑對真姬菇有效成分的提取率相關(guān)性一致。

2.3 真姬菇不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除作用

ABTS法是使用最廣泛的檢測方法之一，它可與過氧化物酶和氫過氧化物在一起形成穩(wěn)定的藍綠色ABTS+陽離子自由基，且在734 nm處有一個特征吸收峰[15]。當樣品中存在抗氧化成分時，可與ABTS+自由基分子發(fā)生反應從而使反應體系褪色，導致溶液的光吸收值下降，其下降程度取決于抗氧化劑的抗氧化能力大小。

圖1 真姬菇各提取物ABTS清除能力Fig.1 ABTS radical scavenging activities of various solvent extracts of Hypsizygus marmoreus

注：A為菇腳，B為小菇，C為成品菇。

之3種樣品真姬菇各溶劑提取物對ABTS自由基的清除能力見圖1。結(jié)果表明樣品濃度在2～10 mg/mL范圍內(nèi)，樣品對ABTS自由基都具有良好的清除作用，且其清除能力均隨著樣品溶液濃度的增加而增加。真姬菇菇腳和小菇萃取物清除ABTS自由基能力的趨勢為：水>甲醇>丙酮>正丁醇；成品菇各種萃取物清除ABTS自由基能力的趨勢為：水>甲醇>正丁醇>丙酮。當濃度達到8 mg/mL時，水提取物和甲醇提取物均能夠達到80%以上的清除率，幾乎與作為對照的抗氧化劑Vc具有相同的清除ABTS自由基能力。丙酮和正丁醇提取物清除能力則相對較差，但在10 mg/mL的濃度時也能達到60%左右的清除率。說明水和甲醇是提取真姬菇中抗氧化成分的良好溶劑，真姬菇中大極性的物質(zhì)清除ABTS自由基的能力較強，該結(jié)果與總酚含量變化情況保持一致。

表3 真姬菇提取物ABTS清除能力的EC50值Table 3 EC50 values of ABTS radical scavenging activities of various solvent extracts of Hypsizygus marmoreus

比較真姬菇3種樣品清除ABTS自由基的能力可以發(fā)現(xiàn)，真姬菇菇腳甲醇提取物的EC50為1.876 mg/mL，與成品菇相比差異極顯著(P<0.01)；小菇水提物、丙酮的EC50為1.109，4.791 mg/mL，顯著高于成品菇與菇腳(P<0.05)。說明當同時以水和甲醇作為溶劑的情況下，菇腳和小菇清除ABTS自由基的能力會優(yōu)于成品菇。

2.4 真姬菇不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除作用

DPPH·是一種穩(wěn)定的以N為中心的自由基，將其溶解在乙醇溶液中呈深紫色，且在517 nm處有一個特征吸收峰[16]。當反應體系中存在抗氧化成分時，它能與DPPH·的單電子配對從而使517 nm 處的吸收峰消失，且顏色變淺的程度與配對電子數(shù)成化學計量關(guān)系[17]。

圖2 真姬菇各提取物DPPH清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activities of various solvent extracts of Hypsizygus marmoreus

注：A為菇腳，B為小菇，C為成品菇。

由圖2可知，在樣品質(zhì)量濃度為0～20 mg/mL范圍內(nèi)，這4種溶劑提取物對DPPH自由基均具有一定的清除能力，它們清除DPPH自由基能力的趨勢均為：水提物>甲醇>丙酮≈正丁醇，同時計算得到真姬菇菇腳、小菇、成品菇水提取物的EC50分別為8.854，10.063，8.941 mg/mL，菇腳提取物與成品菇清除DPPH自由基的能力無顯著差異；甲醇提取物的EC50分別為11.389，12.598，12.839 mg/mL，成品菇提取物清除DPPH自由基的能力顯著高于小菇、菇腳(P<0.05)，丙酮和正丁醇提取物在測試濃度范圍內(nèi)未達50%，該結(jié)果與ABTS清除自由基實驗結(jié)果基本保持一致。

表4 真姬菇提取物DPPH清除能力的EC50值Table 4 EC50 values of DPPH radical scavenging activities of various solvent extracts of Hypsizygus marmoreus

2.5 真姬菇不同溶劑提取物總還原能力的測定

圖3 真姬菇大菇各溶劑提取物Fe3+還原能力Fig.3 Fe3+ reduction abilities of various solvent extracts of Hypsizygus marmoreus

注：A為菇腳，B為小菇，C為成品菇。

鐵還原法是測定樣品還原能力的常用方法，當具有還原能力的還原劑與Fe3+溶液反應時，溶液顏色會由淡黃色變?yōu)闇\綠色，其吸光值在特定波長范圍內(nèi)會升高，從而可以用吸光值的高低來衡量樣品的還原能力，吸光值越高說明樣品的還原能力越強[18]。

由圖3可知，在本實驗選取的濃度范圍(0～20 mg/mL)內(nèi)，反應體系充分混合反應后在700 nm處測得的吸光度會隨著樣品濃度的增大而不斷升高，即樣品的還原能力隨濃度的增大而不斷增強，且上升趨勢較為平緩，劑量效應關(guān)系明顯。當濃度達到20 mg/mL時，4種溶劑的真姬菇提取物反應后得到的吸光度均能達到0.35以上，說明樣品均具有一定的還原能力。菇腳、成品菇總還原能力的趨勢為：水>甲醇>丙酮>正丁醇；而小菇總還原能力的趨勢為：水>甲醇>丙酮>正丁醇。與自由基清除反應相同，真姬菇菇腳、小菇、成品菇水提物的總還原能力最好，濃度達到20 mg/mL時在700 nm的吸光度分別為0.570，0.631，0.553，總還原能力為小菇>菇腳≈成品菇。

2.6 抗氧化活性和總酚含量的相關(guān)性

表5 真姬菇抗氧化活性和總酚含量的相關(guān)性Table 5 Correlation between antioxidant activity and total phenol content of Hypsizygus marmoreus

注：“**”表示在0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

采用線性回歸的方法分析提取物總酚含量與提取物抗氧化活性之間的相關(guān)性，真姬菇菇腳、小菇、成品菇總酚含量與ABTS自由基清除能力呈現(xiàn)負相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.855，-0.808，-0.743；而與總還原能力的相關(guān)系數(shù)分別為0.944，0.909，0.873。結(jié)果表明總酚含量與清除ABTS自由基能力、總抗氧化活性之間存在顯著相關(guān)性，說明提取物中發(fā)揮抗氧化活性的主要成分之一為總酚。對比菇腳、小菇、成品菇3者間的差異可以發(fā)現(xiàn)，相關(guān)性系數(shù)絕對值逐漸降低，表明各提取物間發(fā)揮抗氧化活性的除總酚外，還有非酚類物質(zhì)，如萜類、多糖、Vc等。由于丙酮、正丁醇提取物DPPH自由基清除能力的EC50值無法測算，故相關(guān)性無法計算。有研究表明抗氧化活性及與總酚含量存在一定的相關(guān)性，但不同指標間相關(guān)性差異較大[19]。本實驗中總酚含量與ABTS自由基清除能力呈現(xiàn)出良好的相關(guān)性，該結(jié)果與以往的研究結(jié)果保持一致[20,21]。同時，總酚含量與總還原能力相關(guān)系數(shù)在0.873～0.944之間，這與Lee Y L等的研究存在差異，他們分析發(fā)現(xiàn)真姬菇中的總酚含量與還原力之間不具有相關(guān)性，引起該差異的原因可能是不同真姬菇品種及提取方法的差異導致提取物中總酚含量存在差異。

3 結(jié)論

本實驗采用4種不同溶劑對真姬菇菇腳、小菇和大菇進行提取，并對提取物進行總酚含量的測定，隨后采用了ABTS自由基清除實驗、DPPH自由基清除實驗和Fe3+還原法實驗，測定了所有溶劑提取物樣品溶液的抗氧化能力。

總體來說，4種溶劑提取物的抗氧化能力大小依次是：水提取物>甲醇提取物>丙酮提取物≈正丁醇提取物。比較3種樣品的抗氧化活性可以發(fā)現(xiàn)，菇腳及小菇水提物、甲醇提取物清除ABTS自由基和總還原能力均優(yōu)于成品菇，特別是菇腳、小菇對ABTS自由基的清除能力，當濃度達到8 mg/mL時，水提取物和甲醇提取物均能夠達到80%以上的清除率，幾乎與作為對照的抗氧化劑Vc具有相同的清除ABTS自由基能力。

以上結(jié)論表明，真姬菇菇腳、小菇不同溶劑提取物均具有不同程度的抗氧化能力，尤其是水提物與甲醇提取物。本實驗不僅為真姬菇生產(chǎn)廢料的綜合利用，更為新型天然抗氧化劑的尋找提供了新的可能。