干細(xì)胞治療脊髓損傷的研究進展

李惠民 綜述 申才良 審校

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是由外界暴力直接或間接作用于脊柱，引起脊椎骨的骨折或累及脊髓神經(jīng)節(jié)的損傷。世界范圍中，創(chuàng)傷所導(dǎo)致的SCI大概有133 226萬例，每年新增病例大概有179 312例[1]。治療SCI的方法主要包括藥物治療、手術(shù)治療以及康復(fù)治療，但都只是對癥治療。細(xì)胞移植理論認(rèn)為干細(xì)胞不僅可以自我復(fù)制，而且是具有分化成多種組織細(xì)胞潛能的細(xì)胞。應(yīng)用干細(xì)胞的多向分化潛能，可生成各種組織細(xì)胞，特別是特定的神經(jīng)細(xì)胞，這樣就有可能修復(fù)受損的脊髓組織，恢復(fù)脊髓功能[2]。 目前已有一些早期臨床試驗證明干細(xì)胞移植的可行性[3-4]，該文就干細(xì)胞移植修復(fù)SCI的研究進展進行綜述，以期為臨床上進一步治療SCI提供新的理論依據(jù)。

1 胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

多能胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)可以從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團中獲得。McDonald et al[5]將ESCs注射到挫傷的SCI大鼠脊髓中，發(fā)現(xiàn)存活的ESCs在體內(nèi)分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，而且接受移植的SCI模型的大鼠BBB評分都得到提高。

多能胚胎干細(xì)胞由于必須取材于人類胚胎，臨床應(yīng)用一直存在倫理問題。為了判斷多能胚胎干細(xì)胞移植治療SCI患者的療效，Shroff et al[6]在2015年獲得英國上議院再生醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)委員會認(rèn)可，將胚胎干細(xì)胞通過靜脈注射治療5例下半身癱瘓或者四肢癱瘓的患者，患者都是慢性SCI，根據(jù)美國SCI協(xié)會損傷分級(American Spinal Injury Association Impairment Scale，AIS)的評分標(biāo)準(zhǔn)，接受治療中有兩人評分沒有改變，一人是從A級提升到C級，兩人是從A級提升到B級。在隨訪中，患者在沒有接受免疫抑制劑的情況下都沒有出現(xiàn)畸胎瘤。這項研究表明胚胎多能干細(xì)胞移植治療SCI患者可能是一個有效安全的方法，但是仍然需要更多臨床數(shù)據(jù)的支持。此后Shroff et al[7]將胚胎干細(xì)胞與物理療法結(jié)合在一起治療226例慢性SCI患者，其中有136例是下肢癱瘓，90例是四肢癱瘓，接受治療的患者中A、B、C、D級各有153、32、36、5例，治療后A級提升到B級占15.0%，A級提升到C級占37.3%，B級提升到C級占40.6%，B級提升到D級占3.1%，C級提升到D級13.9%，D級提升到E級占60.0%。這項研究結(jié)果表明物理治療輔助人胚胎干細(xì)胞療法促進SCI患者功能的整體改善。然而，Shroff et al并沒有解釋這篇研究中所涉及的倫理問題。目前關(guān)于ECSs來源的細(xì)胞用于治療SCI的臨床試驗仍然很少，ECSs的安全性需要進一步研究。此外，ECSs來源于有限的胚胎，在體外分化的條件高,這些都制約著ESCs 細(xì)胞建系和廣泛的應(yīng)用。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是由Takahashi et al[8]在2006年首先報道的。當(dāng)時通過在大鼠成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)入Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子，從而形成iPSCs。隨后Takahashi et al[9]在2007年成功的從成人組織中獲取iPSCs。 Miura et al[10]體外實驗證明了iPSCs細(xì)胞可以分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。iPSCs治療SCI的具體機制目前并不清楚，考慮可能由于各種移植干細(xì)胞的作用包括神經(jīng)元細(xì)胞替代、神經(jīng)營養(yǎng)分泌因素、促進血管生成、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)保護。

Tsuji et al[11]從正常鼠中獲取iPSCs，并移植到SCI 9 d后的大鼠受損脊髓，與對照組比較，移植組大鼠后肢運動功能有明顯的恢復(fù)，這種恢復(fù)機制可能是移植細(xì)胞衍生的雙極星形膠質(zhì)細(xì)胞支持脊髓束軸突再生和移植細(xì)胞促進髓鞘再生。Oh et al[12]通過使用SCI后手術(shù)期間移除的椎間盤來源的細(xì)胞產(chǎn)生的iPSC進行動物實驗，研究顯示椎間盤來源的細(xì)胞產(chǎn)生的iPSC表現(xiàn)出和人類胚胎干細(xì)胞相似的特征，并有效分化成神經(jīng)前體細(xì)胞，具有在體外分化為成熟神經(jīng)元的能力，而且移植到SCI后9 d的大鼠受損脊髓后，結(jié)果顯示后肢功能障礙顯著改善。雖然動物實驗證明移植iPSCs對SCI的大鼠后肢運動功能障礙的改善有一定的作用，但是關(guān)于SCI的臨床前和臨床干細(xì)胞移植的研究相當(dāng)匱乏。此外iPSCs的獲取效率仍然較低(0.001%～10%)[13]，最為關(guān)鍵的是iPSCs大多數(shù)是通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒作為轉(zhuǎn)運載體來獲取，重新編程的過程中可能會出現(xiàn)內(nèi)源基因表達(dá)改變，從而增加引起腫瘤的風(fēng)險，這需要研究人員未來在提取方法上進一步完善，提高安全性。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是從骨髓中獲得的一種可以自我更新的多能干細(xì)胞，大約占成人骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.01%，可以通過髂棘穿刺從骨髓中獲得[14-16]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞之所以被一些研究者所喜愛，主要是由于間充質(zhì)干細(xì)胞具有：① 捐贈來源和保存相對比較容易；② 細(xì)胞擴增到臨床應(yīng)用規(guī)模需時短；③ 保存過程效能丟失少；④ 可以減少脫髓鞘，促進神經(jīng)元再生；⑤ 不良反應(yīng)少[17]。

最近，一些研究者發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進神經(jīng)元再生并且減少瘢痕形成的傾向。Okuda et al[18]從雌性Fischer 344大鼠提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼片，與明膠海綿對比，移植到T8水平的SCI的大鼠受損脊髓。結(jié)果表明移植8周后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯減少GFAP陽性的瘢痕細(xì)胞并且大鼠后肢運動功能在移植4周和8周后都得到改善。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用開展的比較早，Sykov? et al[19]2005年首次開展骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床研究，采用椎動脈導(dǎo)管內(nèi)途徑和靜脈途徑兩種移植方式將從7例急性和13例慢性SCI患者的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到患者體內(nèi)，隨訪其中11例患者超過2年沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，結(jié)果得出自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可能是一種安全的方法，但是仍然需要更長的隨訪來證實。Dai et al[20]將自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到20例完全慢性頸脊髓損傷的患者，隨訪6個月后，其中10例患者得到不同程度的功能恢復(fù)，1例患者得到運動功能改善，2例患者得到運動和感覺功能改善，1例患者得到感覺和膀胱功能改善，6例患者得到運動，感覺和膀胱功能改善。在這6個月中，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組沒有出現(xiàn)傷口感染，切口腦脊液漏及腫瘤形成。另外Kakabadze et al[21]將自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到18例完全慢性SCI的患者，隨訪12個月發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞移植后18例中有9例出現(xiàn)不同程度的運動和感覺功能改善。根據(jù)美國SCI協(xié)會的評分標(biāo)準(zhǔn)，9例患者中有7例觀察到1級改善，2例改善了2級。Geffner et al[22]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到8例SCI的患者，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤形成，沒有出現(xiàn)感染或疼痛增加的病例并且患者的生活質(zhì)量得到一定的改善。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于提取、分離，能夠自體移植且組織兼容性好，但是仍然有很多問題需要解決，比如間充質(zhì)干細(xì)胞的生存率，移植的細(xì)胞中CD34+ 表達(dá)量，患者的年齡和性別[19]。

3 神經(jīng)干細(xì)胞

神經(jīng)干細(xì)胞首先在1989年被提出存在于小鼠的腦室下區(qū)，并在1992年首次從小鼠紋狀體組織和腦室下區(qū)中分離出來。這些細(xì)胞能夠自我更新并在體外和體內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。將其移植到受損脊髓后，神經(jīng)干細(xì)胞能夠產(chǎn)生成熟的神經(jīng)表型并在一些SCI模型中促進神經(jīng)功能恢復(fù)。

直接移植神經(jīng)干細(xì)胞到受損脊髓，神經(jīng)干細(xì)胞主要分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞且并不總是可以改善SCI的動物運動功能。一些動物實驗證明，來源于人類胎兒組織或者胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞可以提高SCI動物的功能障礙的恢復(fù)，但是這種來源通常存在倫理問題以及臨床應(yīng)用存在爭議。隨著iPSCs的出現(xiàn)，一些研究者發(fā)現(xiàn)iPSCs可以作為神經(jīng)干細(xì)胞的來源，并且在動物實驗中發(fā)現(xiàn)這種神經(jīng)干細(xì)胞一樣可以改善SCI動物的運動障礙，這種神經(jīng)干細(xì)胞移植到動物脊髓受損區(qū)域，在該區(qū)域大部分分化成神經(jīng)元，但是這項技術(shù)仍然受制于iPSC本身提取效率的低下。此外，為了使神經(jīng)干細(xì)胞移植發(fā)揮更好的作用，一些研究者采取共同療法。Karimi-Abdolrezaee et al[23]將神經(jīng)干細(xì)胞與軟骨素酶ABC(可以下調(diào)硫酸軟骨素蛋白聚糖，從而防止軸突延長細(xì)胞骨架破壞)移植到SCI的大鼠受損脊髓中，結(jié)果顯示皮質(zhì)脊髓束軸突的延長以及移植細(xì)胞和受損區(qū)域整合的提高，并且最終改善大鼠運動功能。有研究者發(fā)現(xiàn)通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞序貫移植到SCI的大鼠體內(nèi)，大鼠運動功能得到改善并且減少神經(jīng)干細(xì)胞膠質(zhì)化的傾向[24]。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后在宿主體內(nèi)無法長期存活、分化不確定性，宋旆文 等[25]體外實驗通過制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，將其和神經(jīng)干細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基可以促進神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化增多，而向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化減少。神經(jīng)干細(xì)胞具備取材不受倫理限制，但是取材有限，獲取材料具有侵襲性，對患者造成二次傷害。而且如何解決神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活率以及如何誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化，仍然需要大量臨床前數(shù)據(jù)才能得出結(jié)論。

4 少突膠質(zhì)祖細(xì)胞

少突膠質(zhì)祖細(xì)胞起源于胚胎發(fā)育的神經(jīng)上皮細(xì)胞，可分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。2005年，Keirstead et al[26]首次報道少突膠質(zhì)祖細(xì)胞改善挫傷的SCI大鼠軸突髓鞘再生和運動功能并且之后有研究顯示少突膠質(zhì)祖細(xì)胞很大程度上可以抵抗NK細(xì)胞的殺傷作用。

Kerr et al[27]將胚胎干細(xì)胞來源的少突膠質(zhì)祖細(xì)胞在損傷后急性期注射到SCI的大鼠模型中，移植8 d后，檢查到少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物包括CNPase、GalC、Olig1、O4和O1，說明這些細(xì)胞至少可以存活8 d。在另外一項研究中，Sharp et al[28]將少突膠質(zhì)祖細(xì)胞移植到頸脊髓損傷大鼠模型以評估前肢運動功能恢復(fù)。移植后第4周到第9周，與對照組比較，實驗組出現(xiàn)明顯前肢步幅長度增加。病理切片顯示移植組病變部位廣泛的白質(zhì)和灰質(zhì)保留，并且沒有出現(xiàn)損傷誘導(dǎo)的空洞。Geron公司在2009年被允許為SCI進行第一個干細(xì)胞治療臨床試驗。在第二年，Geron公司啟動了第一個臨床試驗(第一階段)，以測試完全性胸段水平截癱并喪失運動和感覺功能的患者中人類胚胎干細(xì)胞衍生的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞-GRNOPC1療法的安全性。GRNOPC1是指損傷后14 d內(nèi)用低劑量的200萬個細(xì)胞作用于損傷部位，長期隨訪結(jié)果中沒有發(fā)生嚴(yán)重的不良事件。此外，他們計劃在下一步測試細(xì)胞濃度為2 000萬的安全性。2011年11月，Geron由于經(jīng)濟原因宣布已經(jīng)結(jié)束了SCI干細(xì)胞研究計劃。為了少突膠質(zhì)祖細(xì)胞可以臨床應(yīng)用于SCI的患者，一項裸鼠實驗證明在頸部脊髓損傷后1周內(nèi)注射少突膠質(zhì)祖細(xì)胞可以顯著改善運動功能，并且這種改善和實質(zhì)性空洞減少以及受損部位髓鞘再生有關(guān)。通過大規(guī)模生物分布和毒理學(xué)研究，表明少突膠質(zhì)祖細(xì)胞遷移僅局限于脊髓和腦干，并且沒有造成不良反應(yīng)，產(chǎn)生毒性，異位性或者腫瘤[29]。

5 干細(xì)胞分化細(xì)胞

干細(xì)胞分化細(xì)胞用于治療SCI也有一些研究，并且取得了一些進展。

嗅鞘細(xì)胞是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)特殊的膠質(zhì)細(xì)胞，具有促進神經(jīng)再生和軸突延長的作用。嗅鞘細(xì)胞已經(jīng)開展了臨床實驗，Wu et al[30]遵從嚴(yán)格的倫理學(xué)規(guī)定，從人類16周歲的胎兒體內(nèi)提取的嗅鞘細(xì)胞治療11例慢性SCI患者，患者治療過程中都沒有出現(xiàn)神經(jīng)方面并發(fā)癥，運動功能改善并不明顯，但是可以觀察到感覺功能改善很多，認(rèn)為嗅鞘細(xì)胞是一種安全的方法并且對感覺功能改善作用更大。Tabakow et al[31]將自體嗅鞘細(xì)胞移植到3例完全SCI患者，根據(jù)美國SCI協(xié)會損傷分級的評分標(biāo)準(zhǔn)，3例患者都是A級。隨訪1年后1例從A級提升到C級，1例提升到B級，還有1例雖然沒有提升但是可以觀察到損傷水平以下運動和感覺功能的改善。

施旺細(xì)胞存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng)，可以促進髓鞘再生和軸突延長。一些臨床研究[32]報道施旺細(xì)胞移植似乎是安全的。與同種異體細(xì)胞移植相比，自體細(xì)胞不需要免疫抑制，但細(xì)胞制造的工作量更大，2009～2012年在邁阿密大學(xué)進行的經(jīng)美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)臨床前施旺細(xì)胞移植研究(NCT01739023)，一期安全性研究已經(jīng)啟動，這項研究在2016年已經(jīng)徹底完成，但是目前還沒有相關(guān)文章報道實驗結(jié)果。

6 展望

為達(dá)到挽救SCI患者生命，提高生活質(zhì)量和完全治愈SCI的夢想，細(xì)胞移植治療一直吸引著眾多研究者。雖然有一些臨床研究表明細(xì)胞移植對運動和感覺功能改善起到一些作用且認(rèn)為似乎是一種安全的方法，但是仍然需要更多的臨床前研究以及臨床研究才能最終證實這種方法的療效和安全性。以上提到的幾種干細(xì)胞各有優(yōu)缺點：ESCs具有全能性，可分化方向多，但是取材有限，受到倫理限制；iPSCs具有多能性，取材不受倫理限制，但是提取效率低下，而且和ESCs一樣存在安全性問題；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞來源較廣，不受倫理限制，但是體內(nèi)定向誘導(dǎo)問題亟需解決；少突膠質(zhì)祖細(xì)胞無致瘤性，但是目前取材受到倫理限制；干細(xì)胞分化細(xì)胞臨床應(yīng)用目前較為安全，但是臨床治療效果需要進一步研究。

此外，對于這些細(xì)胞促進修復(fù)和功能改善的機制知之甚少，最常提出的5種機制包括神經(jīng)保護、免疫調(diào)節(jié)、軸突再生、神經(jīng)元再生和髓鞘再生，神經(jīng)保護作用和移植細(xì)胞分泌某些因子有關(guān)，當(dāng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌受損時，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對SCI的神經(jīng)保護作用會下降，但腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量非常低也會影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生存率，這就不清楚受損的脊髓中心組織的減少是由于腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌減少，還是繼發(fā)于其他骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的取決于細(xì)胞存活的神經(jīng)保護作用。免疫調(diào)節(jié)的研究大多數(shù)集中于SCI后細(xì)胞因子釋放的整體變化以及免疫細(xì)胞的豐度，但很少有研究分析移植細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的直接相互作用。移植細(xì)胞可以促進軸突再生，研究人員發(fā)現(xiàn)這種再生能力和受損神經(jīng)元有關(guān)并且可以通過治療提高，但在經(jīng)常研究的挫傷SCI模型中，切斷的軸突數(shù)量是無法量化的。關(guān)于神經(jīng)元再生和髓鞘再生，研究人員通過移植神經(jīng)干祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)存在促進神經(jīng)元再生的作用的同時可能產(chǎn)生異位組織并且發(fā)現(xiàn)髓鞘再生與功能改善有一定相關(guān)性，但是上述研究中并沒有量化移植前髓鞘再生軸突數(shù)量，所以并不能確定內(nèi)在的髓鞘再生是否受到影響。更好地理解這些機制以及發(fā)現(xiàn)應(yīng)用時候的障礙且有效地建立SCI模型對干細(xì)胞移植成為臨床上可行的療法是重要的，并且可能會成為更加具有針對性的療法。