褪黑素與膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)及血清標(biāo)志物的相關(guān)性研究

常冰茹，徐建華，王 康，吳 娟，阮光峰，任家樂，卞福勤，丁長海,2

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和殘疾的常見疾病之一，以關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹饕卣?，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨贅形成、軟骨下骨髓損害等。OA的已知危險因素包括肥胖、增齡和慢性炎癥等，但其發(fā)病機制尚未闡明，故深入研究OA的發(fā)病機制尤為重要。

褪黑素(melatonin，MT)是一種主要由哺乳動物松果體產(chǎn)生的內(nèi)源性吲哚類神經(jīng)激素，淋巴細(xì)胞、巨核細(xì)胞、骨髓、肝臟、胃腸道黏膜和皮膚等也可以分泌。MT具有抗氧化作用，可以清除自由基，參與調(diào)節(jié)多種分子途徑，例如炎癥、增殖、凋亡和遷移?；A(chǔ)研究[1]顯示，MT可能對OA具有保護作用，其可參與調(diào)節(jié)OA軟骨降解過程中的氧化應(yīng)激過程、促炎細(xì)胞因子分泌、線粒體功能紊亂等。鑒于未見相關(guān)臨床研究，故該研究擬測定膝OA患者血清MT及OA血清標(biāo)志物水平，利用磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)評估膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變，探討血清MT水平與膝OA患者血清標(biāo)志物及關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年1月～2013年11月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診的膝OA患者169例，其中男24例，女145例，年齡34～74(55.61±8.54)歲?；颊呔炇鹬橥猓凑彰绹L(fēng)濕病學(xué)會的膝OA診斷標(biāo)準(zhǔn)明確診斷膝OA。其排除標(biāo)準(zhǔn)如下：① 合并其它免疫性疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等；② 嚴(yán)重的OA患者，近一年內(nèi)擬行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)；③ MRI檢查禁忌證者，如裝有心臟起搏器、人工金屬瓣膜、幽閉恐懼癥等。詳細(xì)記錄患者的一般情況，如性別、年齡、病程、身高、體質(zhì)量、職業(yè)、外傷史等，然后對受累側(cè)膝關(guān)節(jié)行MRI檢查。將OA患者以MT中位數(shù)(0.91 ng/ml)水平分為兩組，包括MT高水平組和MT低水平組。

1.2 指標(biāo)測量

1.2.1身高與體質(zhì)量測量 受試者脫鞋免冠，由專人使用同一身高體重計(RGZ-120型)按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行準(zhǔn)確測量。身高及體質(zhì)量分別精確至0.1 cm及0.1 kg以記錄。計算身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)，BMI=體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)。

1.2.2標(biāo)本采集 取患者空腹晨血置入不抗凝干燥試管中，分離血清后保存于-80 ℃冰箱中，ELISA法測定患者血清MT、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)、MMP-10、MMP-13、白介素(interleukin，IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、瘦素、抵抗素和脂聯(lián)素水平。

1.2.3MRI檢測方法 對受試者受累側(cè)膝關(guān)節(jié)(如果雙側(cè)受累，取癥狀較重的一側(cè))進(jìn)行3.0 T-MRI掃描(GE Signa 3.0 T HDXT)，圖像序列包括：① 三維脂肪抑制T1加權(quán)梯度回波序列，翻轉(zhuǎn)角30°，重復(fù)時間(repetition，TR)31 ms，回波時間(echotime，TE)6.71 ms，視野(field of view，F(xiàn)OV)16 cm，矩陣512×512，層厚1.5 mm，無間隔掃描60層，采集時間5 min 58 s；② T2加權(quán)快速自旋回波序列，翻轉(zhuǎn)角90°，TR 3 067 ms，TE 112 ms，F(xiàn)OV 16 cm，矩陣228×256，層厚2 mm，層間隔0.5～1.0 mm，掃描15層。所有圖像信息導(dǎo)入Osirix軟件中，由專人測量。軟骨體積在T1加權(quán)MRI上進(jìn)行測定，測量部位為髕骨軟骨、內(nèi)側(cè)脛骨軟骨和外側(cè)脛骨軟骨。首先利用Osirix軟件測量每個層面的軟骨面積，然后通過軟件計算總軟骨體積。軟骨缺損在T2加權(quán)MRI上進(jìn)行評定，測量部位為髕骨軟骨、內(nèi)側(cè)及外側(cè)股骨軟骨、內(nèi)側(cè)及外側(cè)脛骨軟骨。軟骨缺損評估通過對各個測量部位進(jìn)行評估分級，然后相加得出總評分。軟骨缺損分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級(正常軟骨)；1級(僅有軟骨局灶性低信號或點狀缺損，軟骨表面完整)；2級(缺損厚度<50%)；3級(缺損厚度≥50%)；4級(軟骨全層缺失，暴露軟骨下骨)。軟骨下骨髓損害(bone marrow lesions，BMLs)在T2加權(quán)MRI上測量，測量部位為髕骨、內(nèi)側(cè)股骨、外側(cè)股骨、內(nèi)側(cè)脛骨及外側(cè)脛骨。先對各個測量部位進(jìn)行分級，然后相加計算總BMLs。BMLs分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級(未見軟骨下骨髓損害)；1級(軟骨下骨髓損害面積<總面積的25%)；2級(軟骨下骨髓損害面積介于總面積的25%～50%)；3級(軟骨下骨髓損害面積≥總面積的50%)。

2 結(jié)果

2.1 一般人口學(xué)特征分析MT高水平組和MT低水平組間性別、年齡、BMI、血清瘦素、脂聯(lián)素、MMP-10及MMP-13水平、關(guān)節(jié)軟骨體積、關(guān)節(jié)軟骨缺損和BMLs差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。在MT高水平組中，患者血清MMP-3水平更低，但血清IL-6、TNF-α和抵抗素水平更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 血清MT水平和血清標(biāo)志物的相關(guān)性分析調(diào)整混雜因素(包括性別、年齡和BMI)后，血清MT水平與MMP-3水平呈負(fù)相關(guān)性(OR=0.55，95%CI:0.37～0.81，P=0.03)，血清MT水平與IL-6、TNF-α和瘦素水平呈正相關(guān)性(OR=2.05，95%CI:1.27～3.29；P=0.003；OR=2.25，95%CI:1.40～3.63，P=0.001；OR=1.59，95%CI:1.05～2.42，P=0.028)，與其他血清學(xué)標(biāo)志物無顯著相關(guān)性，見表2。

表1 一般人口學(xué)特征

表2 MT和血清標(biāo)志物的相關(guān)性

*調(diào)整因素為：年齡、性別、BMI

表3 MT和OA關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

*調(diào)整因素為：年齡、性別、BMI

2.3 血清MT水平和膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析調(diào)整混雜因素(包括性別、年齡和BMI)后，血清MT水平和關(guān)節(jié)軟骨體積、關(guān)節(jié)軟骨缺損及BMLs間均無顯著相關(guān)性，見表3。

3 討論

本研究顯示血清MT水平與膝OA患者血清MMP-3水平呈負(fù)相關(guān)性，與血清IL-6、TNF-α和瘦素水平呈正相關(guān)性，與關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)無顯著相關(guān)性。

MMPs參與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，MT可能通過抑制MMPs的產(chǎn)生對OA關(guān)節(jié)軟骨發(fā)揮保護作用。體外實驗顯示MT抑制OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中MMP-3和MMP-13的產(chǎn)生，其阻斷軟骨細(xì)胞中煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)和活化T細(xì)胞核因子-5(nuclear factor of activated T cells-5，NFAT-5)信號通路，從而降低軟骨損傷相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮軟骨保護作用[2]。Wu et al[3]表明MT可降低急性脊髓損傷模型小鼠腦脊液中MMP-3的表達(dá)。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有向軟骨分化的能力[4]。Liu et al[5]研究發(fā)現(xiàn)，在促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞分化的培養(yǎng)基中，MT可促進(jìn)MSCs中軟骨基質(zhì)及軟骨形成基因的表達(dá)，下調(diào)MMP-1、MMP-2、MMP-9和MMP-13的mRNA表達(dá)，減少活性氧的積累，促進(jìn)超氧化物歧化酶的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮軟骨細(xì)胞保護作用。本研究顯示MT和MMP-3水平呈負(fù)相關(guān)性，支持MT可能抑制OA患者M(jìn)MP3的表達(dá)。

越來越多的證據(jù)表明，炎癥在OA中發(fā)揮重要作用，相關(guān)炎癥介質(zhì)包括炎癥細(xì)胞因子、脂肪細(xì)胞因子和生長因子等[6]。Galbo et al[7]發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕性多肌痛患者血清MT、IL-6、IL-8和TNF-α水平均較健康對照者升高。動物實驗[8]顯示，皮下注射MT顯著增加關(guān)節(jié)炎模型小鼠關(guān)節(jié)組織中IL-1β和IL-6水平。Gonciarz et al[9]發(fā)現(xiàn)服用MT可增加非酒精性肝病患者血清瘦素及脂聯(lián)素水平。然而也有研究持相反結(jié)論，Yi et al[10]發(fā)現(xiàn)外源性MT可降低應(yīng)激狀態(tài)下大鼠體內(nèi)IL-1和IL-6的水平。體外實驗[11]顯示MT可抑制SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中IL-1、IL-6和TNF-α蛋白質(zhì)及mRNA的表達(dá)。Celinski et al[12]研究發(fā)現(xiàn)MT可降低肝硬化患者血漿瘦素水平，升高健康受試者血漿瘦素水平。本研究顯示，OA患者血清MT水平和IL-6、TNF-α及瘦素水平呈正相關(guān)性，結(jié)合MT具有抗炎、抗氧化特性，故推測患者血清中MMP-6、TNF-α和瘦素的升高可能反饋性地引起MT的升高以拮抗這種炎癥反應(yīng)。以上這些矛盾的研究結(jié)果可能和MT的給藥劑量、給藥時間、疾病種類、實驗條件及研究方法的差異有關(guān)。MT和OA患者血清炎癥因子及脂肪因子的關(guān)系尚無定論，值得進(jìn)一步研究。

MT和OA關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)相關(guān)性的流行病學(xué)研究目前國內(nèi)外尚無報道。動物實驗[13]顯示關(guān)節(jié)腔注射MT可明顯改善兔OA模型關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)變化。Hong et al[14]發(fā)現(xiàn)單用MT干預(yù)1周可抑制鼠OA模型中MMP-13活性或表達(dá)，明顯改善OA軟骨組織學(xué)形態(tài)異常；MT干預(yù)4周對關(guān)節(jié)軟骨則無明顯保護作用；但其使用CT三維重建技術(shù)顯示，MT聯(lián)合運動長期干預(yù)顯著改善OA小鼠脛骨軟骨下骨損害、骨贅形成及骨小梁厚度，故表明短期使用MT對OA具有保護作用，長期治療效果不明顯，MT聯(lián)合適度運動對OA具有保護作用。本研究顯示血清MT水平和關(guān)節(jié)軟骨體積、關(guān)節(jié)軟骨缺損和BMLs無顯著相關(guān)性，結(jié)果暫不支持MT對膝OA具有保護作用。結(jié)合本研究顯示MT和OA血清標(biāo)志物之間有相關(guān)性，推測MT可能參與調(diào)節(jié)OA血清標(biāo)志物水平，但由于本研究為橫斷面研究，其對膝OA是否發(fā)揮保護作用尚無法給出定論，仍需更多研究闡釋二者之間的關(guān)系。

本研究具有一定的局限性，首先，橫斷面研究的相關(guān)性不能代表數(shù)據(jù)之間的因果關(guān)系，需要縱向研究來進(jìn)一步證明。其次，本研究納入的患者均自醫(yī)院門診連續(xù)收集，不是隨機選擇，可能會導(dǎo)致選擇偏移。最后，本研究檢測的是血清中MT水平，而不是滑液水平，其局部作用仍然未知。

綜上所述，血清MT水平與膝OA患者M(jìn)MP-3水平呈負(fù)相關(guān)性，與血清IL-6、TNF-α和瘦素水平呈正相關(guān)性,與關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)無相關(guān)性。本臨床研究結(jié)果顯示MT在膝OA中可能發(fā)揮一定作用，但需要進(jìn)一步臨床研究證實。