干旱脅迫對(duì)苜蓿幼苗葉綠素?zé)晒馓匦院湍ぶ^(guò)氧化的影響

張翠梅,師尚禮,陳建綱

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心,甘肅 蘭州 730070)

干旱是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育、分布和產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上約有1/3 的地區(qū)屬于干旱和半干旱區(qū)，我國(guó)干旱半干旱地區(qū)約占國(guó)土面積的1/2[1-2]。在我國(guó)黃土高原區(qū)普遍降水量少、蒸發(fā)量大，尤其黃土高原隴中地區(qū)旱災(zāi)十分頻繁，對(duì)紫花苜蓿的種植面積和產(chǎn)量構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[3-4]。

干旱脅迫導(dǎo)致作物及牧草減產(chǎn)主要是通過(guò)影響其葉片的光合功能，抑制光合作用，進(jìn)而導(dǎo)致減產(chǎn)[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，受到干旱脅迫后，多數(shù)植物的光合速率會(huì)下降[6-14]?，F(xiàn)有的研究表明，在植物遭受輕度和中度干旱脅迫時(shí)，光合作用下降的主要原因是氣孔限制，即氣孔導(dǎo)度下降，導(dǎo)致胞間CO2濃度下降，進(jìn)而降低光合速率；而在持續(xù)干旱或重度干旱脅迫時(shí)，因干旱致使葉綠素結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，植物膜系統(tǒng)受損傷，膜脂過(guò)氧化加劇而產(chǎn)生超氧自由基，光合色素嚴(yán)重降解，光合電子系統(tǒng)遭破壞，光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)活性下降，RuBP羧化酶活性受到抑制，從而導(dǎo)致光合作用受損，即所謂的光合作用的非氣孔限制[15-16]。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)是研究光合作用機(jī)制和探測(cè)光合生理狀況的一種新興技術(shù)，在測(cè)定葉片光合作用過(guò)程中光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面具有獨(dú)特的作用。與反映“表觀性”的氣體交換指標(biāo)相比，葉綠素?zé)晒鈪?shù)具有反映“內(nèi)在性”的特點(diǎn)，是研究植物光合生理與逆境脅迫的內(nèi)在探針[17-18]。通過(guò)探討干旱對(duì)植物幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，可有助于分析植物體內(nèi)光合機(jī)構(gòu)運(yùn)行狀況和鑒別植物的不同抵抗或忍耐干旱能力[19-21]。

干旱脅迫下，苜蓿體內(nèi)光合生理指標(biāo)的變化幅度及變化類型與其抗旱性密切相關(guān)，不同品種在抗旱性方面所表現(xiàn)的差異，都有其相應(yīng)的生理生化基礎(chǔ)[22]。已有的干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿光合作用影響的研究多集中在對(duì)其光合特性及葉綠素?zé)晒馓匦訹6-8]、光合速率及葉綠素?zé)晒鈪?shù)日變化規(guī)律[23-24]等方面；而從苜蓿的水分狀態(tài)、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及膜脂過(guò)氧化作用等方面系統(tǒng)分析不同抗旱性苜蓿品種的光合生理適應(yīng)機(jī)制的研究較少。研究不同抗旱性苜蓿品種響應(yīng)干旱的光合生理機(jī)制，對(duì)發(fā)展節(jié)水農(nóng)業(yè)具有重要意義。隴中苜蓿(Medicagosativacv.Longzhong)屬地方品種，長(zhǎng)期生長(zhǎng)在年降水量200～350 mm的黃土高原隴中干旱地區(qū)，該地區(qū)每年連續(xù)5～6個(gè)月的旱災(zāi)經(jīng)常性發(fā)生，連續(xù)8～9個(gè)月旱災(zāi)時(shí)而發(fā)生，隴中苜蓿對(duì)當(dāng)?shù)氐纳L(zhǎng)條件表現(xiàn)出極強(qiáng)的適應(yīng)性[25-26]；隴東苜蓿(Medicagosativacv.Longdong)亦屬地方品種，生長(zhǎng)于年均降水量400～600 mm的黃土高原隴東地區(qū)，抗旱性中等[27]；甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.3)系育成的荒漠綠洲灌區(qū)豐產(chǎn)型品種，抗旱性較弱[24]。因此，通過(guò)PEG-6000 模擬干旱對(duì)不同抗旱性苜蓿品種幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)和膜脂過(guò)氧化程度影響的比較，明確干旱脅迫下不同抗旱性苜蓿品種的光合生理反應(yīng)及適應(yīng)機(jī)制差異，以期為紫花苜蓿品種的選育、推廣和高產(chǎn)栽培提供光合生理生態(tài)方面的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以3個(gè)不同抗旱性紫花苜蓿品種，強(qiáng)抗旱隴中苜蓿、中抗旱隴東苜蓿和弱抗旱甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿為試驗(yàn)材料[28-29]。種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

2017年9月，在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院采用營(yíng)養(yǎng)液砂培法培養(yǎng)幼苗。選擇成熟、飽滿且大小一致的苜蓿種子經(jīng)0.1% HgCl2溶液消毒5 min后，用蒸餾水反復(fù)沖洗，再用濾紙吸干，均勻播種于培養(yǎng)缽中。選用消毒后的細(xì)砂(121℃，高溫滅菌26 min)，裝入直徑為9 cm，高度為11 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，擺放在長(zhǎng)×寬×高為25 cm×15 cm×10 cm的塑料方盆中。播種后將種子轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室中，每天光照14 h，光通量密度400 μmol/(m2·s)，晝夜溫度分別為(25±1)℃和(20±1)℃，相對(duì)濕度60%。每天澆水保證其正常出芽，10 d后進(jìn)行間苗，每缽保留10株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，并采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌。幼苗生長(zhǎng)至42 d時(shí)，每隔2 d每盆澆灌300 mL含PEG-6000(水勢(shì)為-1.2 MPa)的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行脅迫處理，以僅含Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的處理為對(duì)照，連續(xù)培養(yǎng)12 d，分別在處理后0、3、6、9和12 d取樣測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。每處理取3次重復(fù)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定 于光照充足的上午9∶00～11∶00，采用德國(guó)WALZ 生產(chǎn)的便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xPAM-2100 對(duì)葉片進(jìn)行活體測(cè)定。測(cè)定時(shí)，先將葉片置于暗中適應(yīng)20 min，之后照射測(cè)量光<0.5 μmol/(m2·s)測(cè)定初始熒光(Fo)，然后照射飽和脈沖(2 800.0 μmol/(m2·s)測(cè)定最大熒光(Fm)。接著打開內(nèi)源光化光(600.0 μmol/(m2·s))，持續(xù)5 min 后測(cè)定光適應(yīng)下的穩(wěn)定態(tài)熒光(Ft)，隔20 s 打開飽和脈沖(2 800.0 μmol/(m2·s))測(cè)定光適應(yīng)下的最大熒光(Fm′)[30]。根據(jù)所測(cè)定的參數(shù)計(jì)算光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)=(Fm-Fo)/Fo，PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm，PSⅡ光化學(xué)量子產(chǎn)量Yield=(Fm′-Ft)/Fm′，表觀光合電子傳遞速率ETR=Y×PAR(光合有效輻射)×0.50×0.84，光化學(xué)猝滅系數(shù)qP=(Fm′-Ft)/(Fm′-Fo)，非光化學(xué)猝滅系數(shù)qN=(Fm-Fm′)/(Fm-Fo)。

1.3.2 生理指標(biāo)測(cè)定 葉片相對(duì)含水量采用稱重法測(cè)定[33]；葉綠素含量采用丙酮乙醇混合液提取法測(cè)定[32]；超氧陰離子自由基(O2·-)產(chǎn)生速率采用對(duì)氨基苯磺酸法測(cè)定[32]；雙氧水(H2O2)含量采用KI 顯色法測(cè)定[34]；羥自由基(OH·)濃度采用2-脫氧-D-核糖顯色法測(cè)定[35]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[36]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010和Origin 8.0軟件整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)不同抗旱性苜蓿品種葉片相對(duì)含水量(RWC)和葉綠素(Chl)含量的影響

隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，隴中苜蓿，隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)苜縮幼苗葉片的RWC、Chla含量及Chla/b比值不斷下降，Chlb含量不斷增加(圖1A，1B，1C和1D)。脅迫3 d時(shí)，供試苜蓿幼苗葉片的Chlb含量顯著增加，Chla含量和Chla/b比值顯著下降。脅迫6 d時(shí)，供試苜蓿葉片的RWC顯著下降。脅迫第12 d時(shí)，隴中苜蓿，隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)苜蓿幼苗葉片的RWC、Chla含量及Chla/b比值降至最低值，其中RWC的降幅分別為34.14%，44.64%和48.32%；而Chlb含量增至最高值，其增幅分別為100.29%，98.92%和91.93%(P<0.05)。

品種間比較，脅迫第9～12 d時(shí)，隴中苜蓿幼苗葉片的RWC均顯著高于隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)苜蓿(P<0.05)。脅迫第3～12 d時(shí)，隴中苜蓿幼苗葉片的Chla/b比值均顯著高于隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)苜蓿(P<0.05)。

2.2 干旱脅迫對(duì)不同抗旱性苜蓿品種葉片初始熒光(Fo)和最大熒光(Fm)的影響

隨脅迫天數(shù)的增加，供試苜蓿的Fo值呈先增加后下降的變化趨勢(shì)，而Fm值不斷下降(圖2A、2B)。隴中，隴東和甘農(nóng)3號(hào)苜蓿的Fm值在脅迫第9 d時(shí)顯著下降，且在脅迫12 d時(shí)降至最低值，降幅分別為14.26%，20.71%和29.31%(P<0.05)。除脅迫12 d外，供試苜蓿間的Fm值變化差異不顯著(P>0.05)。

2.3 干旱脅迫對(duì)不同抗旱性苜蓿品種葉片潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)和最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響

供試苜蓿幼苗的Fv/Fo和Fv/Fm值隨干旱時(shí)間的延長(zhǎng)均呈不斷下降趨勢(shì)(圖3A,3B)。脅迫9 d時(shí)，隴中苜蓿，隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)的Fv/Fo和Fv/Fm值均開始顯著下降，且在脅迫12 d時(shí)降至最低值，降幅分別為28.42%，29.77%，38.59%和9.83%，8.80%，10.79%(P<0.05)。品種間比較，隴中苜蓿的Fv/Fo值僅在脅迫第6 d時(shí)顯著高于隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)，而在其他脅迫時(shí)間下，三者的Fv/Fo和Fv/Fm值差異不顯著。

圖2 不同干旱脅迫時(shí)間處理下各抗旱性苜蓿品種葉片的Fo和Fm值Fig.2 Dynamics of initial fluorescence (Fo) and maximal fluorescence (Fm) in leaf of different drought-tolerant alfalfa varieties under different drought stress time treatments

圖3 不同干旱脅迫時(shí)間處理下各抗旱性苜蓿品種葉片潛在Fv/Fo和Fv/Fm值Fig.3 Dynamics of potential photochemical efficiency (Fv/Fo) and the maximal chemical efficiency (Fv/Fm) in leaf of different drought-tolerant alfalfa varieties under different drought stress time treatments

2.4 干旱脅迫對(duì)不同抗旱性苜蓿品種葉片光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)的影響

隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，供試苜蓿幼苗的qP不斷下降；隴中苜蓿和隴東苜蓿的qN不斷升高，而甘農(nóng)3號(hào)的qN呈先升高后下降的變化趨勢(shì)(圖4A,4B)。脅迫第6 d，隴中苜蓿，隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)的qP均顯著下降，且在脅迫第12 d時(shí)降至最低值，降幅分別為39.39%，45.74%和65.05%(P<0.05)。供試苜蓿幼苗的qN均在脅迫6 d時(shí)顯著增加，其中甘農(nóng)3號(hào)的qN在脅迫第9 d時(shí)增至最大值，而隴中苜蓿和隴東苜蓿在脅迫第12 d時(shí)增至最大值，增幅分別為78.80%和82.26%(P<0.05)。品種間比較，甘農(nóng)3號(hào)的qP和qN在脅迫9 d時(shí)顯著高于隴中苜蓿和隴東苜蓿；而其qN在脅迫12 d時(shí)顯著低于隴中苜蓿和隴東苜蓿(P<0.05)。

2.5 干旱脅迫對(duì)不同抗旱性苜蓿品種光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量(Yield)及表觀光合電子傳遞速率(ETR)的影響

供試苜蓿的Yield和ETR隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈不斷下降的趨勢(shì)(圖5A，5B)。隴中苜蓿，隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)的Yield和ETR均在脅迫第6 d時(shí)顯著下降，且在脅迫第12 d時(shí)降至最低值，降幅分別為44.91%，56.65%，60.63%和36.50%，51.10%，52.89%(P<0.05)。脅迫第9 d時(shí)，隴中苜蓿的Yield和ETR均顯著高于隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)(P<0.05)；脅迫第12 d時(shí)，隴中苜蓿的ETR較隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)分別高出31.77%和39.43%(P<0.05)。

圖4 不同干旱脅迫時(shí)間處理下各抗旱性苜蓿品種葉片的qP和qN值Fig.4 Dynamics of photochemical quenching (qP) and non-photochemical quenching (qN) in leaf of different drought-tolerant alfalfa varieties under different drought stress time treatments

圖5 不同干旱脅迫時(shí)間處理下各抗旱性苜蓿品種葉片的Yield和ETR值Fig.5 Dynamics of photochemical quantum yield of photosystem II (Yield) and photosynthetic electron transport rate (ETR) in leaf of different drought-tolerant alfalfa varieties under different drought stress time treatments

2.6 干旱脅迫對(duì)不同抗旱性苜蓿品種葉片活性氧(O2· -，H2O2和OH·)與丙二醛(MDA)含量的影響

隨脅迫天數(shù)的增加，供試苜蓿幼苗O2·-產(chǎn)生速率，H2O2含量，OH·濃度和MDA含量均不斷增加(圖6A，6B，6C和6D)。脅迫3 d時(shí)，供試苜蓿的MDA含量均顯著增加，隴中苜蓿和隴東苜蓿O2·-產(chǎn)生速率也顯著增加。脅迫6 d 時(shí)，甘農(nóng)3號(hào)的活性氧(H2O2，OH·和O2· -)含量顯著增加；隴東苜蓿的H2O2含量和OH·濃度也顯著增加，而隴中苜蓿幼苗的H2O2含量和OH·濃度自脅迫9 d時(shí)顯著增加。脅迫第12 d，供試苜蓿幼苗的活性氧(H2O2，OH·和O2· -)和MDA含量均達(dá)到最高值。其中，隴中，隴東和甘農(nóng)3號(hào)苜蓿葉片MDA含量的增幅為240.14%，352.61%和279.61%(P<0.05)。品種間比較，隴中苜蓿的H2O2和OH·含量在脅迫12 d時(shí)均最低，分別較隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)低出12.36%、25.78%、17.39%和18.41%(P<0.05)。

2.7 不同抗旱性苜蓿品種各抗旱生理指標(biāo)間關(guān)聯(lián)性特征及主要成分分析

相關(guān)性分析表明，品種間比較，隴中苜蓿葉片內(nèi)，RWC與Chla/b(r=0.901，P<0.01)正相關(guān)，與Chlb(r=-0.918，P<0.01)負(fù)相關(guān)，與MDA(r=-0.908，P<0.01)負(fù)相關(guān)；Fv/Fo與Fv/Fm(r=0.912，P<0.01)正相關(guān)，qP與Yield(r=0.936，P<0.01)正相關(guān)，qP與qN(r=-0.839，P<0.01)負(fù)相關(guān)；ETR與Yield(r=0.933，P<0.01)正相關(guān)；MDA與O2· -(r=0.928，P<0.01)、H2O2(r=0.969，P<0.01)和OH·(r=0.974，P<0.01)均呈正相關(guān)。隴東苜蓿葉片內(nèi)，RWC與Chla/b(r=0.933，P<0.01)正相關(guān)，與Chlb(r=-0.928，P<0.01)負(fù)相關(guān)，與MDA(r=-0.938，P<0.01)負(fù)相關(guān)；Fv/Fo與Fv/Fm(r=0.980，P<0.01)正相關(guān)，qP與Yield(r=0.967，P<0.01)正相關(guān)，qP與qN(r=-0.915，P<0.01)負(fù)相關(guān)，ETR與Yield(r=0.952，P<0.01)正相關(guān)；MDA與O2· -(r=0.975，P<0.01)、H2O2(r=0.981，P<0.01)和OH·(r=0.973，P<0.01)均呈正相關(guān)。甘農(nóng)3號(hào)葉片內(nèi)，RWC與Chla/b(r=0.900，P<0.01)正相關(guān)，與Chlb(r=-0.833，P<0.01)負(fù)相關(guān)，與MDA(r=-0.777，P<0.01)負(fù)相關(guān)；Fv/Fo與Fv/Fm(r=0.966，P<0.01)正相關(guān)，qP與Yield(r=0.842，P<0.01)正相關(guān)，ETR與Yield(r=0.939，P<0.01)正相關(guān)；MDA與O2· -(r=0.993，P<0.01)、H2O2(r=0.984，P<0.01)和OH·(r=0.979，P<0.01)均呈正相關(guān)(表1，2和3)。

圖6 不同干旱脅迫時(shí)間處理下各抗旱性苜蓿品種葉片活性氧(H2O2，OH·和O2· -)與MDA含量Fig.6 Dynamics ofreactive oxygen species(H2O2，OH·，and O2·-)and malondialdehyde (MDA) in leaf of different drought-tolerant alfalfa varieties under different drought stress time treatments

RWCChl a Chl b Chl a/bFo Fm Fv/FoFv/FmqPqNETRYieldO2·-H2O2OH·MDARWC1Chl a0.828??1Chl b-0.918??-0.869??1Chl a/b0.901??0.940??-0.981??1Fo-0.500??-0.563??0.627??-0.637??1Fm0.557??0.395?-0.640??0.557??-0.432?1Fv/Fo0.695??0.639??-0.803??0.765??-0.819??0.855??1Fv/Fm0.848??0.801??-0.892??0.885??-0.728??0.726??0.912??1qP0.795??0.908??-0.872??0.922??-0.560??0.415?0.640??0.777??1續(xù)表1RWCChl a Chl b Chl a/bFo Fm Fv/FoFv/FmqPqNETRYieldO2·-H2O2OH·MDAqN-0.604??-0.805??0.716??-0.804??0.507??-0.180-0.443?-0.585??-0.839??1ETR0.878??0.962??-0.922??0.961??-0.582??0.488??0.698??0.833??0.918??-0.793??1Yield0.768??0.948??-0.852??0.928??-0.540??0.373?0.608??0.769??0.936??-0.878??0.933??1O2·--0.823??-0.686??0.886??-0.828??0.488??-0.586??-0.673??-0.716??-0.705??0.586??-0.807??-0.659??1H2O2-0.876??-0.685??0.930??-0.852??0.516??-0.666??-0.741??-0.790??-0.701??0.510??-0.796??-0.641??0.959??1OH·-0.907??-0.778??0.956??-0.913??0.524??-0.612??-0.723??-0.818??-0.763??0.655??-0.854??-0.740??0.930??0.961??1MDA-0.908??-0.792??0.981??-0.936??0.551??-0.650??-0.759??-0.835??-0.804??0.641??-0.871??-0.764??0.928??0.969??0.974??1

注：*、**分別表示在5%和1%水平顯著性，下同

表2 干旱脅迫下隴東苜蓿各項(xiàng)耐旱性狀相關(guān)系數(shù)矩陣

表3 干旱脅迫下甘農(nóng)3號(hào)各項(xiàng)耐旱性狀相關(guān)系數(shù)矩陣

主成分分析表明，干旱脅迫下，決定隴中苜?？购敌缘?主成分大小的主要是qN、Yield、Chla、qP、ETR，第2主成分大小的主要是Fm，兩個(gè)主成分均與葉綠素?zé)晒馓匦韵嚓P(guān)的性狀。決定隴東苜?？购敌缘?主成分大小的主要是Chlb、OH·、MDA、Chla/b、H2O2，可以概括為葉綠素及膜脂過(guò)氧化因子；決定甘農(nóng)3號(hào)苜?？购敌缘?主成分大小的主要是H2O2、O2· -、MDA、Fm、OH·，可概括為膜脂過(guò)氧化因子；此外，決定隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)苜蓿第2主成分大小的都是Fo(表4)。

表4 干旱脅迫下各抗旱性苜蓿品種主成分特征向量及貢獻(xiàn)率

3 討論

植物吸收光能后主要有熱耗散、光合作用和熒光3個(gè)去向。其中，絕大部分光能以熱耗散的形式釋放，而用于進(jìn)行光合作用的光能不足吸收光能的20%，還有一部分光能以葉綠素?zé)晒夥绞结尫?，三者之間此消彼長(zhǎng)[18]。光合作用是植物生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，是植物生產(chǎn)力構(gòu)成的最主要因素。干旱脅迫會(huì)抑制光合作用光反應(yīng)中心電子傳遞、光能轉(zhuǎn)換、光合磷酸化及光合作用暗反應(yīng)等一系列過(guò)程[37-38]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)(如Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、Yield、ETR、qP和qN)可以更好地從內(nèi)部快速靈敏、無(wú)損傷地反映PSⅡ的狀態(tài)，成為分析評(píng)價(jià)植物光合機(jī)構(gòu)的功能以及環(huán)境脅迫對(duì)其影響的重要參數(shù)[20-21,39-40]。葉綠素?zé)晒獯銣缦禂?shù)有qP和qN兩種，其中qP反映的是PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額，而qN反映的是PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分[17]。通過(guò)對(duì)不同抗旱性苜蓿品種幼苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，供試苜蓿幼苗的qN顯著增加，而Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、qP、Yield和ETR顯著降低，說(shuō)明干旱脅迫破壞了供試苜蓿的PSⅡ反應(yīng)中心，抑制了PSⅡ光化學(xué)活性，降低了PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率，使PSⅡ潛在活性受損，進(jìn)而破壞了紫花苜蓿的光合作用原初反應(yīng)過(guò)程。這與前人對(duì)干旱脅迫下，番茄(Lycopersiconesculentum)[1]、甜菜(Betavulgaris)[9]、花生(Arachishypogaea)[10]、玉米(Zeamays)[39]和小麥(Triticumaestivum)[4,10]等葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化的研究結(jié)果一致。

供試苜蓿幼苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)相同和差異的響應(yīng)特征。苜蓿的qP、Yield和ETR均在脅迫第6 d時(shí)顯著下降，而Fm、Fv/Fo和Fv/Fm則均在脅迫第9 d時(shí)顯著降低，說(shuō)明超過(guò)一定脅迫時(shí)間的水分虧缺會(huì)引發(fā)苜蓿植株光合機(jī)構(gòu)的異常，同時(shí)影響光合電子的傳遞，進(jìn)而降低了紫花苜蓿的光合作用。相比之下，干旱脅迫下，葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、qP、Yield和ETR)的降幅以強(qiáng)抗旱隴中苜蓿最低，弱抗旱甘農(nóng)3號(hào)最高，且在脅迫第12 d時(shí)，隴中苜蓿的qP和ETR均顯著高于隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)。干旱脅迫第3～12 d時(shí)，供試苜蓿的qN均顯著增加，但脅迫時(shí)間超過(guò)9 d時(shí)，甘農(nóng)3號(hào)qN的增幅降低。說(shuō)明供試苜蓿均能以熱耗散的形式散失葉片吸收的熱能，以防御光抑制帶來(lái)的破壞，從而保護(hù)PSⅡ免受傷害，但甘農(nóng)3號(hào)的熱耗散能力在脅迫超過(guò)9 d時(shí)顯著下降。隴中苜蓿的光合結(jié)構(gòu)受破壞的程度低于隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的非輻射熱耗散能力和較高的電子傳遞速率。這與李超等[24]、謝燕等[41]和張仁和等[42]的研究結(jié)果一致，但與韓瑞宏等[6]的研究結(jié)果不同，可能是由于干旱脅迫下，除PSⅡ反應(yīng)中心電子傳遞活性外，其他因素也會(huì)引起苜蓿光合機(jī)構(gòu)的損傷。因此，試驗(yàn)加入葉片RWC、葉綠素含量及活性氧產(chǎn)生速率等指標(biāo)以系統(tǒng)分析不同抗旱性苜蓿品種響應(yīng)干旱脅迫的光合生理差異[15-16]。

干旱脅迫下，植物的PSⅡ活性降低導(dǎo)致激發(fā)能的上升，引起能量過(guò)剩，產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(ROS)，若不及時(shí)清除ROS會(huì)造成氧化脅迫[12,43]。研究表明，隨脅迫時(shí)間的增加，供試苜蓿的RWC不斷下降，而活性氧(O2· -，H2O2和OH·)和MDA含量均持續(xù)增加，說(shuō)明持續(xù)干旱脅迫會(huì)引起苜蓿細(xì)胞脫水，破壞苜蓿體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)ROS的大量積累加劇了膜脂過(guò)氧化作用，導(dǎo)致光合器官結(jié)構(gòu)與功能的破壞及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝的失調(diào)，最終降低了葉片光合能力[44]。葉綠素含量、葉綠素成分組成及比例在不同植物間有著不同的變化[2,12]。Guo等[12]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，黑果枸杞(Lyciumruthenicum)的Chla，Chlb和Chl(a+b)的含量降低且Chla/b比率增加。而此次研究發(fā)現(xiàn)，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，供試苜蓿的Chla含量和Chla/b比值不斷下降，而Chlb含量卻持續(xù)增加，可能是由于干旱脅迫下，Chla對(duì)ROS的反應(yīng)較Chlb敏感，Chla含量的大幅降低引起了Chla/b比值的下降[45]。脅迫第3～9 d時(shí)，隴中苜蓿的RWC和Chla/b比值顯著高于隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)，而H2O2含量和OH·濃度顯著低于隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)，說(shuō)明一定干旱脅迫條件下，隴中苜蓿具有較高的RWC和Chla/b比值，葉片遭受ROS的氧化損傷程度較輕，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性；而當(dāng)脅迫時(shí)間超過(guò)9 d時(shí)，供試苜蓿的MDA含量變化差異不顯著，說(shuō)明干旱脅迫對(duì)供試苜蓿的膜系統(tǒng)均會(huì)造成嚴(yán)重的氧化損傷，供試苜?？购的芰Φ牟町惪赡芘c其體內(nèi)酶促及非酶促抗氧化系統(tǒng)的協(xié)調(diào)能力有關(guān)。

通過(guò)相關(guān)性分析所測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)密切程度及其與苜?？购的芰Φ年P(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除Fo外，其他指標(biāo)間的相關(guān)密切程度均較高，說(shuō)明干旱脅迫下，供試苜蓿葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化及其體內(nèi)膜脂過(guò)氧化程度能夠同時(shí)反映供試苜蓿的抗旱能力強(qiáng)弱。采用主成分分析進(jìn)一步鑒定出對(duì)供試苜?？购的芰ω暙I(xiàn)較大的指標(biāo)，其中對(duì)隴中苜?？购的芰τ绊懽畲蟮闹饕獮槿~綠素?zé)晒馓匦砸蜃?，而?duì)隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)抗旱能力影響最大的指標(biāo)主要為膜脂過(guò)氧化因子。說(shuō)明隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，不同抗旱性苜蓿品種體內(nèi)的生理指標(biāo)響應(yīng)干旱脅迫的敏感性不同。干旱脅迫對(duì)隴中苜蓿的葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響較小，但卻顯著增加了隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)葉片內(nèi)OH·，H2O2、O2· -和MDA含量，這可能也是隴中苜蓿具有強(qiáng)抗旱性的重要生理原因。然而，試驗(yàn)僅從葉綠素?zé)晒馓匦院湍ぶ^(guò)氧化程度的變化角度研究了不同抗旱性苜蓿品種響應(yīng)干旱脅迫的生理機(jī)制。有關(guān)干旱脅迫下不同抗旱性苜蓿品種葉片PSⅡ光能利用與活性氧代謝協(xié)同調(diào)控的分子機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

隨干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，隴中苜蓿、隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)幼苗的RWC、Chla含量、Chla/b比值、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、qP、Yield和ETR不斷下降；而Chlb含量、ROS(O2· -，H2O2和OH·)和MDA含量不斷增加。但隴中苜蓿葉片RWC、Chla含量、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、Yield和ETR的降幅及H2O2和MDA含量的增幅均低于隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)。供試苜蓿葉片的RWC、Chla、Chla/b、Fm與Fv/Fo、Fv/Fm、ETR、Yield均呈極顯著正相關(guān)，RWC、Chla、Chla/b、Fm、Fv/Fm、qP、ETR、Yield與O2· -、H2O2、OH·、MDA均呈極顯著負(fù)相關(guān)。其中，對(duì)隴中苜蓿抗旱性影響最大的主要為葉綠素?zé)晒馓匦砸蜃?，而?duì)隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)抗旱性影響最大的主要為膜脂過(guò)氧化因子。相比隴東苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)，隴中苜蓿的各項(xiàng)葉綠素參數(shù)受干旱影響小，其抗旱的重要生理原因是具有較強(qiáng)的葉片保水能力，較低的光合機(jī)構(gòu)損傷及膜脂過(guò)氧化程度。