溫度及培養(yǎng)基對(duì)黃花棘豆種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

王玉琴，尹亞麗，鮑根生，宋梅玲，王宏生

(1.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

黃花棘豆(Oxytropisochrocephala)是豆科(Leguminosae)棘豆屬(Oxytropis)多年生草本植物，該植物全草有毒，廣泛分布于甘肅、青海、寧夏、西藏等地區(qū)[1]，其根系發(fā)達(dá)，籽多，生命力強(qiáng)，常呈片狀集中分布，并不斷的滋生蔓延，并與優(yōu)良牧草爭(zhēng)奪生境，使得優(yōu)良牧草比例下降，草地生態(tài)遭到嚴(yán)重破壞。苦馬豆素(swainsonine，SW)是黃花棘豆的主要有毒成分，動(dòng)物長(zhǎng)期或過(guò)量采食可損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響牲畜繁殖能力和畜種改良，并致使牲畜運(yùn)動(dòng)和自控功能降低以致引起肌肉麻痹，乃至窒息死亡[2-4]，極大地降低了草地的利用率，給整個(gè)黃花棘豆危害區(qū)的畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，通過(guò)人工挖除、火燒、應(yīng)用除草劑以及生物防治等方法來(lái)控制黃花棘豆對(duì)放牧動(dòng)物的危害[5]，但由于缺乏對(duì)黃花棘豆的繁殖擴(kuò)散機(jī)理和動(dòng)物中毒機(jī)理的深入了解，因而仍不能從根本上控制棘豆的危害。

研究報(bào)道黃花棘豆除了含有有毒成分苦馬豆素外，還具有豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。王凱[6]報(bào)道青海3種棘豆均含有較高的蛋白質(zhì)，其中黃花棘豆的蛋白質(zhì)含量接近于上等苜蓿。沈明華等[7-9]的研究表明黃花棘豆的粗蛋白含量接近或超過(guò)上等苜蓿干草，且具有較高的粗脂肪、總磷含量顯著高于青海；研究還表明7，8和9月采集的黃花棘豆所含蛋白質(zhì)均較高，其蛋白質(zhì)含量超過(guò)或接近苜蓿干草，且7月的蛋白質(zhì)含量最高，9月的粗脂肪含量最高，黃花棘豆是一種潛在的高蛋白質(zhì)優(yōu)質(zhì)牧草資源。因此，人們一直尋找有效措施對(duì)黃花棘豆進(jìn)行脫毒處理，從而最大限度的利用黃花棘豆。Oldrup等[10]和周啟武等[11]研究發(fā)現(xiàn)在瘋草種子的糊粉層及內(nèi)皮薄壁層分布著內(nèi)生真菌，而種子胚體中沒(méi)有內(nèi)生真菌的分布。Creamer R等[12]研究發(fā)現(xiàn)瘋草內(nèi)生真菌分布在剝離下來(lái)的種皮或薄壁組織層中，而在剝離種皮的種子中沒(méi)有分布，且He等[13]將小花棘豆種子去皮后進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得了無(wú)毒小花棘豆植株。因此，結(jié)合前人的研究結(jié)果，為了進(jìn)一步研究黃花棘豆的脫毒技術(shù)，對(duì)黃花棘豆種子進(jìn)行剝皮處理，通過(guò)研究不同溫度及培養(yǎng)基對(duì)黃花棘豆種子發(fā)芽率及幼苗生長(zhǎng)的影響，篩選最適合黃花棘豆離體種子萌發(fā)及種苗生長(zhǎng)的條件，為黃花棘豆的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用黃花棘豆種子于2015年、2016年9月采自青海省湟源縣，該縣地理位置N 36°25′42.1″，E 101°14′02.3″，海拔3 358 m，采后自然陰干，隨機(jī)挑選籽粒飽滿的種子4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子帶菌率的檢測(cè) 將種子在5% NaOH中浸泡過(guò)夜，用蒸餾水緩慢沖洗1 min，加入20～30 mL乳油-苯胺藍(lán)溶液染色，在水浴中沸煮3～5 min，以保證其充分染色，再用自來(lái)水沖洗3次，然后取1粒種子放在載玻片上，用撥針挑取種皮，加1～2滴染色液，蓋上蓋玻片在電鏡下檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)種皮和糊粉層中內(nèi)生真菌的帶菌率[14]。

1.2.2 種子預(yù)處理 將黃花棘豆種子先用98%濃硫酸溶液浸泡10 min，無(wú)菌水清洗3～5次，70%酒精消毒30 s，再用5.4%次氯酸鈉溶液消毒20 min，最后用無(wú)菌水清洗3～5次。將消毒的種子進(jìn)行剝皮，在無(wú)菌水中浸泡24 h后，進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)[13]。

1.2.3 不同溫度對(duì)黃花棘豆種子發(fā)芽及幼苗的影響 將預(yù)處理好的種子置于MS平板培養(yǎng)基上，分別放入10、15、20、25、30、35和40℃等7個(gè)溫度梯度的人工氣候箱中，進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)溫度下設(shè)10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10粒種子，培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率，種子發(fā)芽以胚根長(zhǎng)等于種子長(zhǎng)一半或芽長(zhǎng)等于種子長(zhǎng)即為發(fā)芽，并于試驗(yàn)的15 d后用直尺測(cè)定幼苗的長(zhǎng)度、根長(zhǎng)以及兩子葉間寬度。

種子發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/總種子數(shù)×100%

1.2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)黃花棘豆種子萌發(fā)及幼苗的影響 選用MS、SH、N6、White、LS、MT、B5等7種培養(yǎng)基[15]，將預(yù)處理的種子分別置于培養(yǎng)基上，放入相對(duì)濕度為85%，16 h光照/8 h黑暗，溫度為25℃的人工氣候箱中，進(jìn)行種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基的篩選。每個(gè)培養(yǎng)基下設(shè)10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10粒種子，培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率，15 d后用直尺測(cè)量幼苗的長(zhǎng)度、根長(zhǎng)以及兩子葉間寬度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

所有數(shù)據(jù)釆用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，運(yùn)用SPSS 22.0分析軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行各指標(biāo)的顯著性差異分析，同時(shí)通過(guò)對(duì)各培養(yǎng)基的因子分析確定主成分，并計(jì)算各主成分得分，再利用綜合得分公式求出各培養(yǎng)基綜合分值，進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子帶菌率的檢測(cè)

通過(guò)檢測(cè)黃花棘豆種子中種帶內(nèi)生真菌情況，發(fā)現(xiàn)黃花棘豆種皮帶菌率達(dá)98%，種胚帶菌率為0(見(jiàn)圖1)。

2.2 不同溫度對(duì)黃花棘豆種子萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)影響

隨著培養(yǎng)溫度的變化，黃花棘豆種子發(fā)芽率變化明顯，培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，黃花棘豆種子發(fā)芽率最高(94.72%)。培養(yǎng)溫度在10～25℃時(shí)，隨著溫度的升高，種子發(fā)芽率也逐漸升高，當(dāng)培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，種子發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)。方差分析顯示，黃花棘豆種子在培養(yǎng)溫度為10℃時(shí)，種子發(fā)芽率顯著低于其他溫度(P<0.05)，15～40℃種子發(fā)芽率差異不顯著，但總體呈先上升后下降趨勢(shì)(表1)。

表1 溫度處理下黃花棘豆種子的發(fā)芽率

通過(guò)測(cè)定黃花棘豆幼苗的長(zhǎng)度、根長(zhǎng)以及兩子葉間寬度得到幼苗莖葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)以及兩子葉間寬度在10～40℃時(shí)變化均呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，幼苗莖葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)以及兩子葉間寬度均達(dá)到最大值，且莖葉長(zhǎng)顯著高于其他溫度處理(P<0.05)，其次為25℃，幼苗根長(zhǎng)和兩子葉間寬度在20～30℃時(shí)差異不顯著。結(jié)合圖3分析，黃花棘豆種子在25～30℃生長(zhǎng)明顯，35℃之后種子出現(xiàn)畸形，因此，種子萌發(fā)的最適溫度在25～30℃。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)黃花棘豆種子萌發(fā)及幼苗的影響

7種培養(yǎng)基對(duì)黃花棘豆種子發(fā)芽率的影響有差異，其中，發(fā)芽率最高的是N6培養(yǎng)基，顯著高于SH、White，LS和B5培養(yǎng)基(P<0.05)，其次為MS、MT，但這3種培養(yǎng)基差異不顯著。通過(guò)測(cè)定黃花棘豆幼苗的長(zhǎng)度、根長(zhǎng)以及兩子葉間寬度(圖5)得到，兩子葉寬度最大的是LS培養(yǎng)基，顯著高于其他培養(yǎng)基(P<0.05)；幼苗長(zhǎng)度最長(zhǎng)的是White培養(yǎng)基，其次為SH和N6；幼苗根長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為MT，其次為White，LS和SH培養(yǎng)基，根長(zhǎng)最短的是B5培養(yǎng)基。根據(jù)不同培養(yǎng)基對(duì)種子發(fā)芽率、兩子葉寬、莖葉長(zhǎng)以及根長(zhǎng)的影響，通過(guò)主成分分析可得，黃花棘豆種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為MT培養(yǎng)基(表2)。通過(guò)圖6觀察可知，幼苗在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況也不相同，在B5上生長(zhǎng)最差，并出現(xiàn)畸形。在MT，White和N6培養(yǎng)基上幼苗根生長(zhǎng)良好，但地上部分生長(zhǎng)明顯較弱，MS，SH和LS培養(yǎng)基上幼苗生長(zhǎng)良好。

圖1 黃花棘豆種皮及糊粉層帶菌狀況Fig.1 Seed coat and aleurone layer with endophytic fungi of Oxytropis ochrocephala

圖2 不同溫度處理下黃花棘豆幼苗長(zhǎng)度、根長(zhǎng)及兩子葉間寬Fig.2 Effects of temperature on length，root length and width between two cotyledons of seedling

圖3 不同溫度處理下黃花棘豆幼苗的生長(zhǎng)情況Fig.3 Effects of temperature on the seedling

圖4 不同培養(yǎng)基處理下黃花棘豆種子的發(fā)芽率Fig.4 Effect of different media on seed germination rate of Oxytropis ochrocephala

圖5 不同培養(yǎng)基處理下黃花棘豆幼苗長(zhǎng)度、根長(zhǎng)及兩子葉間寬Fig.5 Effects of different media on length，root length and width between two cotyledons of seedling

圖6 不同培養(yǎng)基處理下的黃花棘豆幼苗Fig.6 Effects of different media on seedling

序號(hào)培養(yǎng)基F1F2F排序1SH-0.107-0.799-0.34452N60.9020.5760.79023White-0.205-1.955-0.80564LS0.9010.3540.71435MT1.4500.3981.08916B5-2.8130.641-1.62977MS-0.1280.7860.1864

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于黃花棘豆的研究主要集中在黃花棘豆的中毒調(diào)查[16]、對(duì)放牧家畜的危害[17-18]、有毒成分的研究[19-20]及營(yíng)養(yǎng)成分分析等方面[6]，對(duì)于黃花棘豆種子的研究，也主要集中在種子化學(xué)成分分析[21]、種子休眠破除方法以及光照、恒溫及變溫對(duì)種子發(fā)芽率的影響[22-25]，但對(duì)黃花棘豆的開(kāi)發(fā)利用研究相對(duì)較少。由于黃花棘豆種皮的內(nèi)皮層及糊粉層分布著內(nèi)生真菌，經(jīng)檢測(cè)其帶菌率為98%，但種胚內(nèi)的帶菌率為0，所以通過(guò)物理方法將黃花棘豆種皮剝除，用黃花棘豆種胚進(jìn)行試驗(yàn)，目的是獲得無(wú)毒的黃花棘豆幼苗，并設(shè)置不同溫度及不同培養(yǎng)基進(jìn)行黃花棘豆組織培養(yǎng)過(guò)程中種子萌發(fā)階段的最佳條件篩選，試驗(yàn)結(jié)果表明黃花棘豆種子萌發(fā)的最佳溫度為25℃，幼苗生長(zhǎng)的較適溫度為25～30℃，這與陳超等[25]、趙清梅等[26]研究在溫度為25℃時(shí)黃花棘豆種子發(fā)芽率最高的結(jié)果一致，說(shuō)明不論直接用培養(yǎng)皿里放入滅菌濾紙還是用組織培養(yǎng)的方式對(duì)黃花棘豆種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，黃花棘豆的種子發(fā)芽的最適溫度均為25℃。但該結(jié)果與陸家芬等[23]的研究結(jié)果15～20℃為黃花棘豆的適宜發(fā)芽溫度，且溫度為25℃時(shí)，種子霉變率較高不同，這可能是由于消毒不徹底，種子發(fā)芽前處理不同以及采取的發(fā)芽方式不同導(dǎo)致。

試驗(yàn)結(jié)果表明，7種培養(yǎng)基對(duì)黃花棘豆種子發(fā)芽率的影響差異明顯，其中發(fā)芽率最高的是N6培養(yǎng)基，顯著高于SH，White，LS和B5培養(yǎng)基(P<0.05)，其次為MS、MT，通過(guò)測(cè)定黃花棘豆幼苗的長(zhǎng)度、根長(zhǎng)得到，幼苗長(zhǎng)度最長(zhǎng)的是White培養(yǎng)基，其次為SH和N6；幼苗根長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為MT，其次為White，LS和SH培養(yǎng)基，根長(zhǎng)最短的是B5培養(yǎng)基，試驗(yàn)經(jīng)過(guò)主成分分析得到黃花棘豆種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為MT培養(yǎng)基。自1937年White建立第一個(gè)植物組織培養(yǎng)基以來(lái)，許多研究者報(bào)道了各種培養(yǎng)基，其數(shù)量多，配方各異，目前常用的植物組織培養(yǎng)基有MS、White、B5、N6、Nitsh、Miller、SH、LS等，其中White培養(yǎng)基主要用于生根培養(yǎng)；N6主要為水稻等禾谷類(lèi)作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì)；B5主要特點(diǎn)是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫銨素，適合于某些雙子葉植物特別是木本植物的生長(zhǎng)；SH在不少單子葉和雙子葉植物上使用，效果很好；MS是目前最為廣泛的一種培養(yǎng)基，能夠滿足組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的需求，有加速養(yǎng)物生長(zhǎng)的作用[15]。在試驗(yàn)中雖然經(jīng)過(guò)主成分分析得到黃花棘豆種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為MT培養(yǎng)基，但經(jīng)過(guò)對(duì)比培養(yǎng)基配方，MT除了有機(jī)物部分比MS含量增加，其他成分均相同，再結(jié)合幼苗生長(zhǎng)情況，MT培養(yǎng)基上的幼苗地上部分比MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)弱。另外，雖然N6培養(yǎng)基的種子發(fā)芽率最高，但是N6上幼苗生長(zhǎng)較弱，因此，為了給黃花棘豆無(wú)毒株系提供優(yōu)良的組織培養(yǎng)種苗，最終將黃花棘豆的最佳組織培養(yǎng)培養(yǎng)基確定為MS培養(yǎng)基。

4 結(jié)論

通過(guò)比較不同培養(yǎng)溫度及不同培養(yǎng)基下黃花棘豆種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)狀況，隨著培養(yǎng)溫度的變化，黃花棘豆種子發(fā)芽率變化明顯，25℃下種子發(fā)芽率最高，為94.72%，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，幼苗莖葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)以及兩子葉間寬度均達(dá)到最大值，且在10～40℃種子發(fā)芽率、幼苗莖葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)及兩子葉間寬度均呈先上升后下降趨勢(shì)。7種培養(yǎng)基中發(fā)芽率最高的是N6培養(yǎng)基，通過(guò)主成分分析得到黃花棘豆種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為MT培養(yǎng)基，但經(jīng)過(guò)對(duì)比培養(yǎng)基配方，將最終培養(yǎng)基確定為MS培養(yǎng)基。