1型糖尿病動物模型和干細(xì)胞治療的研究進(jìn)展

陳昕濤，王敏君，嚴(yán)文韜，孫 宇，楊 桃，朱海英，胡以平，*，陳 費，*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員四大隊，上海 200433)

糖尿病是一種以高血糖為特征，由致病因素引起胰島素分泌缺乏或胰島素抵抗繼而引發(fā)糖代謝紊亂的疾病。目前分為1型糖尿病、2型糖尿病、特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿病。1型糖尿病是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，由于胰腺β細(xì)胞被破壞導(dǎo)致胰島素分泌相對不足，進(jìn)而使機(jī)體多器官長期暴露于高血糖環(huán)境，導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管、眼、腎及神經(jīng)系統(tǒng)病變。如治療不當(dāng)或不及時將會出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，輕者影響患者的生活質(zhì)量，重者導(dǎo)致患者死亡[1]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟的統(tǒng)計，截至2015年，全球已有4.15億糖尿病患者，另有3.18億成年人處于糖耐量異常狀態(tài)，而糖耐量異常的人群發(fā)生糖尿病的風(fēng)險很高。目前1型糖尿病主要治療方法是藥物治療，患者需要保證不間斷高質(zhì)量的胰島素注射。1型糖尿病患者目前仍無法治愈，終生藥物治療增加了感染、酮癥酸中毒、低血糖等急性并發(fā)癥及視網(wǎng)膜、神經(jīng)、腎臟、心腦血管疾病等慢性并發(fā)癥的風(fēng)險。胰腺β細(xì)胞的再生治療和替代治療或成為治愈1型糖尿病的有效途徑，但這種治療方式面臨的難題是胰腺β細(xì)胞來源不足及在體內(nèi)血糖調(diào)節(jié)功能不能長久維持。相關(guān)研究表明，通過對干細(xì)胞誘導(dǎo)分化、重編程以及轉(zhuǎn)分化技術(shù)獲得的有功能的胰島素分泌細(xì)胞具有廣闊的前景，而糖尿病的動物模型作為研究細(xì)胞替代法治療1型糖尿病的驗證工具起到了至關(guān)重要的作用。本文根據(jù)目前的研究現(xiàn)狀綜述了1型糖尿病常見動物模型以及相關(guān)干細(xì)胞治療這些模型的研究進(jìn)展，以期引發(fā)思考，開闊思路，為干細(xì)胞治療1型糖尿病的臨床轉(zhuǎn)化提供參考和借鑒。

1 1型糖尿病常見動物模型

1型糖尿病的主要特征是胰腺β細(xì)胞受到自身免疫系統(tǒng)的攻擊，導(dǎo)致胰島素分泌不足。因此，在制備動物模型時，可以通過不同的方法使動物胰島素缺失。根據(jù)造模的不同方法，1型糖尿病動物模型主要包括3大類型：化學(xué)損傷胰腺β細(xì)胞1型糖尿病動物模型、自發(fā)性1型糖尿病動物模型、病毒感染誘導(dǎo)1型糖尿病動物模型。

1.1 化學(xué)損傷法制備1型糖尿病動物模型

該方法主要通過化學(xué)手段對胰腺β細(xì)胞進(jìn)行大量破壞，導(dǎo)致內(nèi)源性的胰島素急劇減少，引發(fā)模型動物糖耐量異常、高鎂血癥和體質(zhì)量減輕等癥狀[2]。由化學(xué)損傷法制備1型糖尿病動物模型操作十分簡便，既可以用于對嚙齒類動物造模，也適用于更高等的動物。如向豬注射化學(xué)試劑可以誘導(dǎo)1型糖尿病的發(fā)生[3]。一般通過兩種試劑來引發(fā)1型糖尿?。烘滊遄艟?streptozotocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan，ALX)。

STZ是一種使胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生毒素的廣譜抗菌素，它通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(GLUT2)轉(zhuǎn)運到胰腺β細(xì)胞，導(dǎo)致其DNA發(fā)生烷基化，生成NO和自由基，破壞細(xì)胞，致使β細(xì)胞無法分泌胰島素，因而出現(xiàn)1型糖尿病癥狀[4]。STZ注射一般有兩種方式，一是單次大劑量注射，注射藥物劑量為150～200mg/kg。單次大劑量注射操作方便省力，用藥節(jié)約，但模型的成模率不是很高；另一種方式為多次低劑量注射STZ，劑量通常為50mg/kg，連續(xù)5d，低劑量注射逐步損傷胰島細(xì)胞，可以引發(fā)自身對胰島的免疫應(yīng)答，最終使模型動物血糖調(diào)節(jié)失代償，出現(xiàn)多飲、多尿、血糖持續(xù)偏高的1型糖尿病癥狀。相比于單次大劑量注射，多次低劑量注射的成模率高，且死亡率低[5]。單次大劑量注射STZ的誘導(dǎo)模型目前廣泛用于1型糖尿病藥物試驗，而多次小劑量誘導(dǎo)模型主要用于探討胰島壞死以及增殖的機(jī)制。

四氧嘧啶(ALX)是一種尿酸類衍生物，進(jìn)入機(jī)體代謝后產(chǎn)生5-羥基巴比土酸、過氧化物和超氧自由基。超氧自由基與葡萄糖轉(zhuǎn)運體GULT2結(jié)合，進(jìn)入胰島β細(xì)胞后使DNA烷基化，因而可以選擇性的破壞胰腺β細(xì)胞，引起胰島素缺乏，致使模型動物出現(xiàn)1型糖尿病典型癥狀。ALX的注射劑量通常為100～200mg/kg，缺點是對機(jī)體的其他器官毒性很大，因此不能通過加大劑量的腹腔注射來取代尾靜脈注射，但劑量不足又會導(dǎo)致成模率不高。有研究[6]表明劑量為37.5mg/kg分3次隔天注射的方案較為合適，這樣對胰腺β細(xì)胞的損傷作用較為緩和，血糖逐步上升，可以明顯降低模型動物死亡率并提高成模率。

上述的兩種化學(xué)法通過化學(xué)毒素類物質(zhì)破環(huán)胰島細(xì)胞，可以在較短時間內(nèi)引起胰島素分泌大量減少，一定程度上模擬出了1型糖尿病患者多飲、多尿、血糖增高、體質(zhì)量減輕的癥狀。因STZ和ALX的穩(wěn)定性不強(qiáng)，所以在注射時應(yīng)注意試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，遮光保存等。

1.2 自發(fā)性1型糖尿病動物模型

1.2.1 NOD小鼠 NOD小鼠(non-obesediabeticmouse)是JCL-ICR品系的糖尿病小鼠近親雜交而得到的非肥胖型小鼠，其生理特征是多飲、多尿、高血糖，與人類的1型糖尿病癥狀十分接近，屬于自發(fā)胰島素依賴型糖尿病小鼠。NOD小鼠從發(fā)病到死亡的時間約為22d，在發(fā)病之前，會伴有胰腺炎、胰島素分泌逐漸減少的癥狀。NOD小鼠自身免疫性胰島炎最早于4周齡時發(fā)生，患鼠的胰島會被淋巴細(xì)胞浸潤形成胰腺炎，進(jìn)而導(dǎo)致胰島的萎縮和纖維化。NOD小鼠與人類1型糖尿病有所不同的是，即使沒有胰島素的注射治療，NOD小鼠也可存活數(shù)周，不會因為酮血癥而死亡[7]。目前，NOD小鼠主要用于1型糖尿病藥物的篩選以及1型糖尿病遺傳機(jī)制的研究。

1.2.2 BB大鼠 BB大鼠是于1974年由加拿大渥太華Bio-Breeding生物育種實驗室發(fā)現(xiàn)的，其發(fā)病是由于遺傳型和自身免疫反應(yīng)所致。BB大鼠的自身免疫系統(tǒng)如T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞會毀壞胰腺β細(xì)胞，引起胰腺炎而導(dǎo)致胰島素分泌缺乏。與NOD小鼠不同的是，BB大鼠會因胰島素缺乏引發(fā)的酮血癥而很快死亡，并且CD8+和CD4+淋巴細(xì)胞會減少[8]。BB大鼠的臨床表現(xiàn)與人類1型糖尿病十分相似，所以BB大鼠作為1型糖尿病模型被廣泛使用。

自發(fā)性糖尿病動物模型可以很好的模擬出1型糖尿病的臨床癥狀，其遺傳性和人類的1型糖尿病十分相似，因此是作為研究干細(xì)胞治療1型糖尿病的理想動物模型。

1.3 病毒感染法誘導(dǎo)1型糖尿病動物模型

病毒可以通過兩種方式誘導(dǎo)1型糖尿病的發(fā)生：一是病毒直接感染胰腺β細(xì)胞，導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞大面積被破壞，如Kilham大鼠病毒；二是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對胰腺β細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生特異性免疫疾病，如腦心肌炎病毒。此外也有研究培育出了轉(zhuǎn)基因動物模型，該模型中胰島素啟動子啟動淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitisvirus，LCMV)抗原的表達(dá)。此模型小鼠平時不會出現(xiàn)胰腺β細(xì)胞被破壞的癥狀，一旦注射LCMV便會引起小鼠機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答和抗原交叉反應(yīng)，進(jìn)而損傷胰腺β細(xì)胞，誘發(fā)小鼠產(chǎn)生1型糖尿病[9]。

1.4 其他動物模型

目前，對于1型糖尿病動物模型的研究，主要集中于嚙齒類動物，但嚙齒類成模后的病理特征與人類有著較大差異。不僅如此，對于1型糖尿病的治療方法，嚙齒類動物與人的治療效果也存在著較大差異，如對于口服胰島素和煙堿，嚙齒類動物可以取得很好的效果，但卻不適用于人類。因此，對于小型豬與猴等哺乳動物的1型糖尿病動物模型的研究便孕育而生，通常也使用STZ誘導(dǎo)其產(chǎn)生1型糖尿病。其中，尤卡坦小豬和哥廷根小豬相對其他品種有著實驗周期短、血液生化指標(biāo)與人類相似的優(yōu)勢[10-11]。在所有的動物模型中，與人類的血糖指標(biāo)、病理特征最為相似的是猴類模型，有報道使用恒河猴成模效果較好[12]。生理上，小型豬與猴的胃腸結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)吸收、胰腺發(fā)育和形態(tài)以及脂質(zhì)代謝機(jī)制與人類相似，尤其值得注意的是豬胰島素與人類只差一個氨基酸，因此，豬胰島的異種移植也成為治療1型糖尿病的方法[13]。但因倫理、實驗成本等問題，大型動物試驗受到了一定的限制。

2 干細(xì)胞對1型糖尿病動物的治療作用

目前治療1型糖尿病的主要方法為注射胰島素使患者消除高血糖的癥狀，但缺點在于藥物治療具有胰島素終生依賴性，部分患者存在胰島素抵抗，胰島素將糖化的血紅蛋白下降的同時也易造成低血糖，并且外源性胰島素的注射不能有效避免因糖尿病引起的如視網(wǎng)膜病變、心血管病變、腎臟病變等并發(fā)癥的發(fā)生。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，胰島細(xì)胞移植成為治療1型糖尿病的候選方案，但是該方法存在著供體不足和患者本身的排異反應(yīng)等問題，因而限制了其廣泛應(yīng)用。近年來，干細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)的發(fā)展和多能干細(xì)胞的獲得，為1型糖尿病的細(xì)胞治療帶來了新的突破口。干細(xì)胞具有多向分化的潛能和自我更新能力，理論上可以誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞進(jìn)而通過移植來修復(fù)或者替代原來受損的胰島。此方法的另一潛在優(yōu)勢在于，可用自體來源的細(xì)胞以避免排斥反應(yīng)。目前可以分化為胰腺β細(xì)胞的干細(xì)胞有胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞等，成體干細(xì)胞主要包括肝干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等。

2.1 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞被證實可誘導(dǎo)分化為包括胰腺β細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)體細(xì)胞。有研究將胚胎干細(xì)胞在體外通過轉(zhuǎn)染胰島素基因的方法，在分化階段加入煙酰胺獲得了具有分泌胰島素功能的細(xì)胞，將該細(xì)胞簇移植到STZ小鼠體內(nèi)，STZ小鼠高血糖的癥狀得到了一定程度的緩解，但持續(xù)時間不長。在此基礎(chǔ)上，有研究[14]采用分步定向法誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞，將得到的胰島樣細(xì)胞簇移植到STZ小鼠體內(nèi)，形成了類胰島組織，小鼠存活期延長。誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向胰腺β細(xì)胞分化的過程十分復(fù)雜，目前發(fā)現(xiàn)通過ActivinA、丁酸鈉、Exendin4等誘導(dǎo)因子可以較為高效地獲得高純度和高成熟度的胰島素分泌細(xì)胞。

胚胎干細(xì)胞的胰向分化為治療1型糖尿病提供了希望，其優(yōu)點在于細(xì)胞數(shù)量充足，但目前的分化方案所得的胰島素分泌細(xì)胞效率不高，葡萄糖刺激后胰島素分泌量低，無法實現(xiàn)血糖的生理調(diào)節(jié)。此外，胚胎干細(xì)胞的分化移植仍面臨癥狀反復(fù)、免疫排斥、具有成瘤風(fēng)險等問題。因此，若想投入臨床，還需探求更合理的胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)因子和誘導(dǎo)分化方案[15-17]。

2.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是在特定條件下(如病毒轉(zhuǎn)染外源基因，或者化合物處理等方法)由體細(xì)胞獲得的具有多項分化潛能的干細(xì)胞，具有胚胎干細(xì)胞的相關(guān)特性和功能。Zhu等[18]將體細(xì)胞來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在體外分化得到的胰島素生成細(xì)胞，移植到1型糖尿病小鼠體內(nèi)后，可以分泌胰島素。有學(xué)者[19]將恒河猴的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為具有分泌胰島素功能的細(xì)胞，隨后移植到免疫缺陷的1型糖尿病小鼠體內(nèi)，可以降低小鼠50%的血糖水平。

相較于胚胎干細(xì)胞，源于自體的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞免疫原性低，移植后有望代替胰腺β細(xì)胞行使分泌胰島素的職能。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的優(yōu)勢在于可源于自體、免疫原性低、暫無倫理學(xué)問題，但還存在重編程機(jī)制不清、效率低、變異風(fēng)險高、多潛能細(xì)胞致瘤性等問題，因此廣泛應(yīng)用于臨床還為時尚早。

2.3 成體干細(xì)胞

成體干細(xì)胞是指存在于成年后各組織器官中具有自我更新能力和一定分化潛能的細(xì)胞。該類細(xì)胞最大的優(yōu)勢在于1型糖尿病患者可通過從自體中分離出成體干細(xì)胞，在體外定向誘導(dǎo)分化為具有分泌胰島素功能的胰腺β細(xì)胞，再移植回體內(nèi)達(dá)到長期治療的目的；相較于胚胎干細(xì)胞而言，既克服了由于異體細(xì)胞移植而引起的免疫排斥，也避免了相應(yīng)的倫理問題，成為新的研究熱點。

2.3.1 肝干/前體細(xì)胞 肝臟與胰腺具有發(fā)育同源性，胚胎期均起源于前腸末端[20]。有研究[21]表明肝干細(xì)胞可以作為胰腺β細(xì)胞替換治療的一種候選細(xì)胞。在肝干細(xì)胞向胰腺細(xì)胞分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子胰十二直腸同源基因-1(pancreaticduodenal homeobox-1，PDX-1)是關(guān)鍵的調(diào)控基因之一。有研究表明將PDX-1的重組腺病毒轉(zhuǎn)染至小鼠肝前體/干細(xì)胞之后，經(jīng)體外培養(yǎng)可以誘導(dǎo)其分化為分泌胰島素的β樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有胰腺β細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征和相關(guān)表型，移植到1型糖尿病小鼠模型中可以改善小鼠的高血糖癥狀。肝干細(xì)胞作為候選細(xì)胞具有一定應(yīng)用前景，其優(yōu)勢在于易于擴(kuò)增以及與胰腺同樣起源于內(nèi)胚層，利于誘導(dǎo)分化。但是肝干細(xì)胞目前體外分化效率不高，因此，需要探討更高效的誘導(dǎo)分化方案。

2.3.2 胰腺干/前體細(xì)胞 目前認(rèn)為胰腺前體細(xì)胞分布在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、胰腺實質(zhì)和腺泡內(nèi)。Smukler等[22]將胰管和胰島組織中PDX1+/胰島素+/GLUT2-細(xì)胞通過譜系追蹤和流式分選相結(jié)合的方法，在體外擴(kuò)增并誘導(dǎo)分化為胰腺β細(xì)胞，移植后改善了STZ小鼠高血糖癥狀。也有研究[23]利用PDX1、NGN3(neurogenin3)和巨噬細(xì)胞激活因子A(macrophageactivating factorA，MafA)將胰腺中外分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成胰島素分泌細(xì)胞，移植后也可減輕糖尿病動物模型高血糖的癥狀。胰腺干/前體細(xì)胞目前面臨的問題是存在部位不明確、所得量稀少以及缺乏有效的體外擴(kuò)增方法。

2.3.3 間充質(zhì)干細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，取材方便且分布廣泛，可以來源于脂肪、臍帶、臍血、骨髓等。Neshati等[24]將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到1型糖尿病小鼠中，可以長期穩(wěn)定的改善小鼠高血糖癥狀。但有研究發(fā)現(xiàn)移植人骨髓干細(xì)胞的小鼠胰腺組織中并未發(fā)現(xiàn)源于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的胰島樣細(xì)胞，因此認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞并不是直接分化為分泌胰島素的細(xì)胞，而是遷移到胰島后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以刺激胰腺β細(xì)胞的再生，調(diào)節(jié)全身免疫反應(yīng)，通過抑制T細(xì)胞的增殖，保護(hù)胰腺β細(xì)胞免受T淋巴細(xì)胞的破壞。間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子來修復(fù)受傷組織，改善胰腺β細(xì)胞的生存微環(huán)境[25-26]。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞還可以用于改善1型糖尿病的并發(fā)癥，如糖尿病腎病。Lee等[27]將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)左心房注射入STZ小鼠，可在腎小球中檢測到人源性CD31陽性細(xì)胞，可以判斷骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到腎臟分化形成了內(nèi)皮細(xì)胞，起到保護(hù)腎小球的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞治療1型糖尿病有著很大的前景，其優(yōu)點在于來源廣泛、自體移植免疫排斥小，但也有一些潛在問題，如誘導(dǎo)分化的效率不高、機(jī)制不明、有成瘤性的危險等。

3 展望

合適的1型糖尿病動物模型對于評價干細(xì)胞分化得到的胰腺β細(xì)胞有著重要的作用。嚙齒類動物雖然造模容易、數(shù)據(jù)重復(fù)性較高且成本相對較低，但是不能完全模擬人1型糖尿病臨床癥狀，因此無法正確評價干細(xì)胞的治療效果。小型豬和猴的1型糖尿病模型是目前評價干細(xì)胞是否有治療效果的理想模型。綜上來看，不同來源的干細(xì)胞向胰腺β細(xì)胞分化是可行的，這為細(xì)胞替代法治療1型糖尿病拓寬了方向。由于干細(xì)胞來源的不同，分化方法的差異，不同干細(xì)胞得到的胰腺β細(xì)胞狀態(tài)和功能不盡相同，所獲得的胰腺β細(xì)胞在體內(nèi)是否能分泌足夠的胰島素以及是否能響應(yīng)血糖的動態(tài)變化來滿足機(jī)體長期的需求還有待探索。