溫度脅迫對紫貽貝與翡翠貽貝生理活動的影響和Hsp27的響應(yīng)

王 靜，姚翠鸞

(集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021)

0 引言

溫度是影響海洋生物分布、生理活動及生活行為的重要環(huán)境因子之一[1]。環(huán)境溫度決定了變溫動物的新陳代謝率。溫度對貝類影響的研究顯示，高溫和低溫都會減弱其有氧代謝能力[2-3]，增強無氧代謝[4]。海水溫度異常以及鹽度的劇烈波動等環(huán)境因子的脅迫會影響貝類的耗氧率和排氨率，例如華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)[5]、企鵝珍珠貝(Pteriapenguin)[6]與翡翠貽貝(Pernaviridis)[7]的排氨率在一定溫度范圍內(nèi)，會隨溫度的升高而增加；斑馬貽貝(Dreissenapolymorpha)[8]的氧消耗率則隨季節(jié)發(fā)生變化。海水溫度的適當升高可以加快貝類體內(nèi)的各種生化反應(yīng)速率，使得呼吸和代謝速度加快。但貝類屬潮間帶生物，常暴露于空氣中，而溫度暴露脅迫對于貝類的呼吸和代謝影響的相關(guān)研究鮮有報道。

脅迫環(huán)境下，生物體細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)不能正常折疊，容易發(fā)生錯誤折疊或者相互聚集。生物為了響應(yīng)這種脅迫，則通過大量合成具有修復損傷功能的蛋白酶和分子伴侶來幫助細胞恢復活性[9]。Hsp27作為熱激蛋白家族成員，可以抑制蛋白質(zhì)聚集，防止細胞發(fā)生凋亡。魚類的相關(guān)研究[10-12]表明，Hsp27的表達與熱應(yīng)激、胚胎發(fā)育以及水污染密切相關(guān)。貽貝常年生活在巖石上，更容易受到環(huán)境溫度的脅迫，然而關(guān)于Hsp27在貽貝抗溫度暴露脅迫的研究較少。

紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)也稱地中海貽貝，在我國東海以及南海北部廣泛分布，由于繁殖迅速，具有生長優(yōu)勢，已經(jīng)被列為世界百大入侵物種之一[13]。在惡劣環(huán)境下，紫貽貝具有較強的適應(yīng)能力。據(jù)報道在美國加利福尼亞部分海岸帶，紫貽貝已經(jīng)成功取代了本地貽貝種海灣貽貝(M.trossulus)，并且相比于其他同種貽貝，紫貽貝高溫適應(yīng)性更強[14]。翡翠貽貝屬暖水性貝類，特點是生長迅速，繁殖周期較短，在我國主要分布于南海、東海南部和臺灣海峽沿岸[15]。由于其廣泛性以及對環(huán)境脅迫的高耐受性，翡翠貽貝同樣已經(jīng)成為高度入侵物種和生物污染物種[16]。本研究通過紫貽貝與翡翠貽貝的溫度暴露脅迫實驗，對比分析兩種溫度適應(yīng)性不同的貽貝耗氧率、排氨率、鰓組織結(jié)構(gòu)的變化以及鰓組織Hsp27的蛋白表達水平，以期探究溫度脅迫對這兩種貽貝的影響及其抗脅迫反應(yīng)，并為管理氣候變化條件下的海洋生物提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及溫度脅迫方案

紫貽貝購于遼寧省大連市(39°51′N,121°50′E)，殼長(7±1)cm，采樣時間為2016年10月，樣本量為200個；翡翠貽貝購自福建省廈門市(24°26′N， 118°04′E)，殼長(6±1)cm，采樣時間為2016年8月，樣本量為200個。樣本運至集美大學海水試驗場暫養(yǎng)，期間將附著在貽貝殼上的污損生物逐一去除，養(yǎng)殖海水為經(jīng)過沉淀砂濾后的自然海水，鹽度約為26。暫養(yǎng)期為3周，紫貽貝暫養(yǎng)水溫控制在(15±1)℃，翡翠貽貝暫養(yǎng)溫度為(25±1)℃，保證持續(xù)充氣，每天換水三分之一，早晚各投喂兩次螺旋藻粉(1 g/m3)。

選擇暫養(yǎng)后健康的貽貝，參照Lockwood等[14]的研究設(shè)計實驗溫度，將貽貝置于干露狀態(tài)，分別進行低溫及高溫脅迫。紫貽貝脅迫溫度分別為4，8，25，35 ℃，對照溫度15 ℃；翡翠貽貝脅迫溫度分別為8，15，35，42 ℃，對照溫度25 ℃。升降速率均為3 ℃/h(溫控儀，CSi8D，USA)。當溫度達到預設(shè)脅迫溫度后，維持1 h，迅速將貽貝置于對照溫度的海水中，進行24 h恢復。每個溫度組設(shè)置3個重復。

取樣時間點實驗組為干露狀態(tài)下脅迫1 h，對照組為溫度海水中恢復24 h。使用解剖刀將貽貝閉殼肌劃開后，在冰浴條件下迅速解剖，每個平行組取6只貽貝，分別取左側(cè)鰓組織并混合為1個樣本，設(shè)置3個重復組(N=3)，經(jīng)液氮速凍后，放入-80 ℃保存。

1.2 耗氧率與排氨率的測定

R0=[(O0-Ot)×V]/(W×t)，

其中：R0為單位體重耗氧率(mg·g-1·h-1)，O0與Ot分別為實驗開始和結(jié)束時呼吸瓶水中的DO值(mg/L)，V代表呼吸瓶中水的體積(L)，W為紫貽貝與翡翠貽貝軟體組織的干重(g)，t代表實驗持續(xù)時間(h)。

貽貝的排氨率(RN)的計算公式為

RN=[(Nt-N0)×V]/(W×t)，

1.3 石蠟組織切片

溫度脅迫后，每個平行組取6只貽貝，分別取左側(cè)鰓組織，經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗后放入4%(體積分數(shù))中性甲醛固定液中，固定24 h后，進行水洗、乙醇逐級脫水、透明、浸蠟與包埋、切片、展片、HE染色和封片后[18]，置于光學顯微鏡下(DM3000LED，Leica，德國)觀察鰓組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.4 免疫印跡分析

取0.5 g鰓組織樣品加入 500 μL RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0，0.1% SDS，0.5% 脫氧膽酸鈉，1% NP-40，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1PMSF，使用前加入蛋白酶抑制劑PMSF)，用勻漿儀進行組織破碎，置于冰上30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清，用Bradford法測蛋白濃度。在蛋白樣品中加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，等量取出50 μg總蛋白，于12% SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，美國)上，用預染蛋白檢測轉(zhuǎn)膜效率，PBST和PBS清洗干凈后用1%的BSA室溫封閉1 h，一抗(Hsp27，ab2790，Abcam；β-actin，4970，華安生物)按照1∶1000比例稀釋后4 ℃孵育過夜，洗滌后再用以辣根過氧化物酶標記的二抗(北京全式金)(1∶5000)室溫孵育1 h，洗滌后用ECL化學發(fā)光劑(Advansta，美國)顯影，放入生物分子成像儀(ImageQuant Las4000 mini成像儀，GE，美國)曝光拍照，使用ImageJ分析Hsp27及β-actin蛋白表達變化。Hsp27蛋白表達水平的計算以β-actin作為內(nèi)參。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 耗氧率

如圖1a所示：低溫脅迫后紫貽貝耗氧率顯著低于對照組(P<0.01)，4 ℃脅迫后耗氧率達到最低值，為對照組的0.6倍，經(jīng)過24 h恢復后，低溫刺激組耗氧率有所上升，但仍顯著低于對照組(P<0.05)；在高溫25 ℃脅迫下，耗氧率顯著升高，達到最大值，為對照組的1.4倍(P<0.01)，但在35 ℃脅迫下，耗氧率顯著低于對照組(P<0.01)，經(jīng)24 h恢復后，高溫刺激組都恢復至對照水平。由圖1b可知：翡翠貽貝在低溫脅迫后，耗氧率顯著低于對照組(P<0.01)，8 ℃脅迫后達到最低值，為對照組的0.6倍，恢復24 h后8 ℃脅迫組仍顯著低于對照組(P<0.01)；高溫35 ℃脅迫后，耗氧率無顯著變化，但42 ℃脅迫后顯著升高，達到對照組的1.3倍，高溫脅迫組恢復24 h后都回到對照組水平。

2.2 排氨率

如圖2a所示：低溫脅迫后，紫貽貝排氨率顯著低于對照組(P<0.01)，4 ℃脅迫后達到最低，為對照組的0.5倍，恢復24 h后，低溫脅迫組恢復到對照組水平；高溫35 ℃脅迫后，排氨率顯著高于對照組(P<0.01)，達到對照組的1.6倍，經(jīng)24 h恢復后，仍顯著高于對照組(P<0.01)。由圖2b可知：翡翠貽貝在低溫8 ℃脅迫后，排氨率顯著降低(P<0.01)，最低值為對照組的0.6倍，恢復24 h后仍顯著低于對照組(P<0.01)；低溫15 ℃脅迫對排氨率無顯著影響；高溫35 ℃脅迫后，排氨率顯著升高(P<0.05)，但42 ℃脅迫后，排氨率顯著降低(P<0.01)，恢復24 h后，高溫脅迫組與對照組無顯著差異。

2.3 鰓組織結(jié)構(gòu)

顯微鏡下觀察的貽貝鰓組織結(jié)構(gòu)如圖3所示。由圖3a可見：低溫脅迫后，紫貽貝鰓絲間隔加大，鰓纖毛脫落，恢復24 h后鰓絲間隔縮小，鰓纖毛無法恢復；高溫25 ℃刺激后，鰓組織與對照組相比并沒有顯著變化；35 ℃脅迫后，鰓絲纖毛搭接處斷裂、鰓絲受損、細胞核外溢，恢復24 h并無明顯變化。由圖3b可見：翡翠貽貝鰓組織經(jīng)低溫脅迫后，鰓絲間隔加大，鰓絲纖毛搭接處斷裂；高溫35 ℃刺激出現(xiàn)同樣現(xiàn)象，經(jīng)24 h恢復后少量鰓絲纖毛恢復；但42 ℃高溫脅迫后，鰓纖毛脫落，鰓絲斷裂，且恢復24 h后組織損傷不可逆。

2.4 鰓組織Hsp27蛋白表達變化

如圖4a所示：低溫脅迫后，紫貽貝鰓組織Hsp27蛋白的表達量顯著升高(P<0.01)，經(jīng)8 ℃脅迫后達到最大值，為對照組的2.5倍，經(jīng)24 h恢復后Hsp27表達水平與對照組無顯著性差異。如圖4b所示：低溫8 ℃脅迫后，翡翠貽貝鰓組織Hsp27的表達水平無顯著變化，但恢復24 h后顯著低于對照組(P<0.05)；15 ℃脅迫后，Hsp27的表達水平顯著升高(P<0.01)，達到對照組的2倍，恢復24 h后與對照組無顯著差異；高溫35 ℃脅迫后，Hsp27的表達水平顯著高于對照組(P<0.01)，恢復24 h后回到對照組水平；42 ℃脅迫后，Hsp27的表達水平無顯著變化，但恢復24 h后顯著低于對照組(P<0.01)。

3 討論

環(huán)境溫度是影響海洋無脊椎動物新陳代謝水平的重要因素，溫度的頻繁變化會導致生物細胞理化性質(zhì)、能量收支、免疫機能等的改變，從而導致機體正常代謝受阻[19]。耗氧率和排氨率常用于檢測水生動物在環(huán)境脅迫下的生理及能量收支狀況[20]。本研究結(jié)果顯示，低溫脅迫會造成紫貽貝耗氧率顯著降低(P<0.01)。已有研究表明，低溫會顯著減弱貝類的正常呼吸及其他生理活動，例如蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[19]、長牡蠣(Crassostreagigas)[21]、南非鮑(Haliotismidae)[22]以及翡翠貽貝[7]。本研究在35 ℃以下，紫貽貝耗氧率隨著溫度的上升而增加，但在35 ℃脅迫后顯著下降(P<0.01)(見圖1a)。文獻[23]研究表明，厚殼貽貝的耗氧率也會隨溫度的升高而增加，但達到溫度峰值后則下降。以上結(jié)果表明，35 ℃可能已經(jīng)超過了紫貽貝最適的溫度上限，過高的溫度導致了貽貝正常呼吸受到抑制?；謴?4 h后，紫貽貝低溫脅迫組耗氧率得到部分恢復，說明耗氧率可以通過溫度的改善而有所上升，但是恢復24 h無法回到正常水平。翡翠貽貝的耗氧率同樣在低溫脅迫后顯著低于對照組(P<0.01)，并隨溫度的增加而上升(見圖1b)。林小濤等[17]的研究結(jié)果顯示翡翠貽貝在16～31 ℃溫度范圍內(nèi)，耗氧率會隨著溫度的升高而增加。但是本研究結(jié)果顯示在42 ℃脅迫后，翡翠貽貝耗氧率達到最高值，表明此溫度可能是翡翠貽貝的耐受上限溫度。

低溫干露脅迫會造成紫貽貝排氨率顯著降低(P<0.01)，樊甄姣等[24]的實驗結(jié)果表明，低溫會造成水生生物體液流動緩慢，進而使得代謝水平降低，因此本研究結(jié)果提示低溫脅迫可能會對貽貝的代謝產(chǎn)生抑制作用。但紫貽貝在35 ℃刺激下排氨率達到最大值(見圖2a)，恢復24 h后，35 ℃刺激恢復組仍顯著高于對照組(P<0.05)，這表明溫度的升高會加速貝類體內(nèi)各種生化反應(yīng)速率，致使機體的新陳代謝加快[7]，并且溫度急性脅迫后貝類需要消耗更高的能量[25]。低溫8 ℃干露脅迫會導致翡翠貽貝排氨率降低，且隨溫度的升高而逐漸上升，但42 ℃脅迫后，排氨率顯著下降(見圖2b)。當環(huán)境溫度急劇升高，海洋生物會以自身的代謝補償來提高代謝率[26]，但是當達到生物耐受上限時，代謝率可能會出現(xiàn)急劇降低。本研究結(jié)果表明，紫貽貝與翡翠貽貝的呼吸代謝會受到溫度暴露的影響，且在極端溫度脅迫后無法恢復正常水平，可能是由于溫度影響了貝類正常的酶活性，從而改變了貝類的生理生化活動[21]。紫貽貝在受到高溫脅迫后，耗氧率降低而排氨率增加，提示溫度過高可能會加速其機體分解代謝，另外，低溫脅迫后其恢復能力較強。翡翠貽貝在受到高溫脅迫后，氧代謝加速，但是排氨率降低，提示其應(yīng)對高溫脅迫可能不同于紫貽貝，另外，受到溫度脅迫后其恢復正常水平可能需要更長時間。以上結(jié)果表明紫貽貝可能通過減少耗氧，加速分解代謝應(yīng)對高溫脅迫，而翡翠貽貝則是通過增加耗氧，降低分解代謝來應(yīng)對。

鰓不僅是貝類的呼吸器官，也是攝食器官，通過鰓絲纖毛的擺動可以過濾海水中的食物，并起到運輸氣體及離子交換等作用[27]。本實驗結(jié)果顯示：低溫脅迫后，紫貽貝鰓絲間隔增大；高溫35 ℃脅迫后，鰓絲纖毛搭接處斷裂，鰓絲斷裂并發(fā)生細胞核外溢的現(xiàn)象(見圖3)，且恢復24 h后，鰓組織結(jié)構(gòu)無顯著改變。魚類的相關(guān)研究結(jié)果指出，低氧[28]、高溫[29]及空氣暴露[30]均可以導致魚的鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。低溫造成魚類的鰓絲面積減小，可以降低鰓的呼吸表面積，從而改善缺氧狀況[31-32]。由此可見，貽貝在低溫暴露脅迫下，可能通過加大鰓絲間隔改變鰓表面積以應(yīng)對環(huán)境溫度的變化。對照組15 ℃干露脅迫后，紫貽貝鰓纖毛出現(xiàn)少量脫落，但并不顯著，說明短時間的干露脅迫對鰓組織結(jié)構(gòu)造成一定損傷，這可能是由缺氧引起，但損傷程度低，并可在一定時間內(nèi)恢復。在貝類的研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧脅迫下，鰓纖毛顯著脫落，且鰓絲纖毛搭接處斷裂[33]。本研究在25 ℃下鰓組織結(jié)構(gòu)也無明顯損傷，表明紫貽貝可能對適度的高溫有一定耐受性。溫度脅迫后，翡翠貽貝鰓組織結(jié)構(gòu)的變化趨勢與紫貽貝類似，但在8 ℃脅迫后鰓絲間隔增大，并且鰓纖毛脫落及鰓絲纖毛搭接處斷裂，而8 ℃下紫貽貝僅觀察到增加的鰓絲間隔，表明該溫度下翡翠貽貝的損傷程度可能更為嚴重。高溫脅迫后，翡翠貽貝鰓組織同樣出現(xiàn)鰓纖毛脫落及鰓絲斷裂的現(xiàn)象。以上結(jié)果顯示在極端的溫度暴露下，貽貝鰓組織結(jié)構(gòu)可能會出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的損傷，從而破壞機體對環(huán)境因子的調(diào)節(jié)機制。與紫貽貝相比，翡翠貽貝鰓組織在低溫8 ℃與高溫42 ℃下?lián)p傷嚴重，程度均高于紫貽貝，這可能與其溫度耐受性有關(guān)。

溫度刺激會引起生物體細胞骨架以及線粒體的損傷，而熱休克蛋白可以修訂錯誤的蛋白折疊，從而維持細胞穩(wěn)態(tài)[34-35]。研究表明，Hsp27的過量表達可以抑制細胞凋亡，發(fā)揮保護細胞的作用[36]。本實驗結(jié)果顯示，低溫脅迫會造成紫貽貝鰓組織Hsp27表達水平的顯著升高(P<0.01)(見圖4a)。魚類的相關(guān)研究顯示，低溫脅迫會顯著提高大黃魚Hsp27的轉(zhuǎn)錄水平[37]。以上表明低溫可以顯著誘導紫貽貝Hsp27的表達水平以響應(yīng)脅迫。有研究表明熱應(yīng)激會顯著提高紫貽貝Hsp27的轉(zhuǎn)錄表達[38]，然而本實驗結(jié)果顯示，高溫脅迫對紫貽貝鰓組織Hsp27蛋白表達無顯著影響，這可能是由于紫貽貝在高溫響應(yīng)過程中，Hsp27轉(zhuǎn)錄與蛋白表達存在一定差異。適度的低溫和高溫脅迫均會造成翡翠貽貝鰓組織Hsp27蛋白表達的顯著升高(P<0.01)(見圖4b)，這表明Hsp27可能在翡翠貽貝抗低溫和高溫脅迫方面發(fā)揮重要作用。低溫脅迫可以誘導這兩種貽貝鰓組織Hsp27的過量表達，提示Hsp27可能在貽貝應(yīng)答溫度脅迫過程中起到減輕細胞損傷或者幫助細胞進行修復的功能，而高溫脅迫后，紫貽貝與翡翠貽貝Hsp27表達不同，提示這兩種貽貝的高溫響應(yīng)機制可能存在差異。

綜上所述，在一定溫度范圍內(nèi)，貽貝的耗氧率與排氨率會隨溫度的升高而增加，但在較高的脅迫溫度下，機體代謝水平會顯著改變。低溫和高溫脅迫導致貽貝鰓組織結(jié)構(gòu)改變，低溫造成鰓絲間隔加大，鰓纖毛脫落，而高溫則造成鰓絲斷裂，細胞核外溢。低溫可以誘導紫貽貝鰓組織Hsp27的過量表達，而翡翠貽貝Hsp27則是在適度低溫及高溫脅迫后顯著表達，表明兩種貽貝抵抗溫度脅迫的應(yīng)答反應(yīng)存在差異，紫貽貝對低溫響應(yīng)更積極，而翡翠貽貝應(yīng)對極端低溫與高溫的主動反應(yīng)能力更弱。