β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶對速溶綠茶粉水溶液香氣的影響

方 可 ，李 婷 ，朱艷冰 ，2，3，黃高凌 ，2，3，楊遠(yuǎn)帆 ，2，3，倪 輝 *，2，3

（1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361021；3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

速溶茶粉是以成品茶葉為原料，經(jīng)水提取、濃縮、干燥等工藝加工而成的可溶性粉狀物質(zhì)[1]，它是重要的茶葉深加工產(chǎn)品，是加工茶飲料、茶糕點(diǎn)等食品的原料。依據(jù)原料茶葉的不同，速溶茶一般可分為速溶紅茶、速溶綠茶、速溶烏龍茶、速溶白茶、速溶黃茶、速溶黑茶、速溶花茶、速溶調(diào)配茶等[2]。在速溶茶粉提取生產(chǎn)過程中，由于原料茶葉香氣成分的揮發(fā)及降解和氧化[3]，導(dǎo)致速溶茶粉及其加工產(chǎn)品的香氣遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如原料茶葉。人們先后研究了多種改良速溶茶粉質(zhì)量的技術(shù)，如膜分離技術(shù)、低溫濃縮技術(shù)、香氣回填技術(shù)等[4-5]。此外，人們發(fā)現(xiàn)茶葉產(chǎn)品中含有香氣前體，在酶的作用下可釋放出香氣成分，該方法具有特異性，對其他品質(zhì)成分影響小[6]；因此，酶工程技術(shù)是改良速溶茶粉及其加工產(chǎn)品（茶飲料）風(fēng)味的重點(diǎn)研究領(lǐng)域。

相關(guān)研究表明，茶葉中的香氣前體主要是糖苷類物種，包括單糖苷和二糖苷[7]。β-葡萄糖苷酶（βglucosidase，EC 3.2.1.21）和 α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）是兩種重要的糖苷酶，其中β-葡萄糖苷酶水解結(jié)合于非還原性末端的β-D-葡萄糖苷鍵[8]；α-L-鼠李糖苷酶水解末端α-L-鼠李糖苷鍵[9]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)黑曲霉胞外粗酶可提高速溶茶粉水溶液及茶飲料香氣物質(zhì)含量[10-11]，并研究了β-葡萄糖苷酶對茶飲料香氣的影響[12]，但尚未系統(tǒng)研究β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶以及這兩種酶的協(xié)同作用對速溶茶粉水溶液及茶飲料等產(chǎn)品香氣的影響。

針對以上研究現(xiàn)狀，以我國產(chǎn)量最大的速溶茶粉--速溶綠茶粉為原料，分別用β-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶以及混合酶對速溶綠茶粉水溶液進(jìn)行處理，綜合運(yùn)用GC-MS、感官評價(jià)和風(fēng)味強(qiáng)度值（OAV）分析等方法評價(jià)香氣特征變化，旨在闡明β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶對速溶綠茶粉水溶液香氣的改良效果，為提高速溶茶粉加工產(chǎn)品的風(fēng)味提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

噴干型速溶綠茶粉：購于大閩（漳州）食品有限公司；β-葡萄糖苷酶：購于上海源葉生物科技有限公司；黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶：作者所在實(shí)驗(yàn)室按照表達(dá)純化制備得到。環(huán)己酮、正構(gòu)烷烴（C8-20）、2-甲基呋喃、2-乙基呋喃、N-乙基吡啶、芳樟醇、壬醛、癸醛、反式-β-羅勒烯、α-萜品烯、萜品油烯、γ-萜品烯、2-庚酮、α-蒎烯、莰烯、β-香葉烯、水芹烯、2-壬酮、α-法尼烯：購于美國Sigma公司；香葉醇、苯甲醛、藏花醛、順式-3-己烯醇、水楊酸甲酯、2-甲基丁酸己酯、傘花烴、檸檬烯、反式-β-羅勒烯、己醇：購于英國Alfa Aesar公司。

1.2 主要儀器

手動(dòng) SPME進(jìn)樣器和 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司產(chǎn)品；Rtx-5MS色譜柱：美國Restek公司產(chǎn)品；QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （GC-MS）：成都島津儀器設(shè)備有限公司（成都）產(chǎn)品；RO-03A制冰機(jī)：日歐制冷設(shè)備有限公司（深圳）產(chǎn)品；GZX-DH電熱恒溫干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠（上海）產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備 速溶綠茶粉水溶液 （IGT）：稱取3 g速溶綠茶粉于60 mL頂空瓶中，加入30 mL純水，在40℃水浴鍋中保溫；β-葡萄糖苷酶處理后的速溶綠茶粉水溶液（GIGT）：稱取3 g速溶綠茶粉于60 mL頂空瓶中，加入30 mL純水和β-葡萄糖苷酶（10 U），在40℃水浴鍋中保溫；α-L-鼠李糖苷酶處理后速溶綠茶粉水溶液（LIGT）：稱取3 g速溶綠茶粉于60 mL頂空瓶中，加入30 mL純水和α-L-鼠李糖苷酶（13 U），在40℃水浴鍋中保溫；β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶混合酶處理后的速溶綠茶粉水溶液（GLIGT）：稱取3 g速溶綠茶粉于60 mL頂空瓶中，加入30 mL純水和β-葡萄糖苷酶（10 U）、α-L-鼠李糖苷酶（13 U），在 40 ℃水浴鍋中保溫。

1.3.2 樣品氣味特征的感官評價(jià) 根據(jù)ISO 8589標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)方法對各樣品的青草香、花香、甜香、木香和焦糖香進(jìn)行感官評價(jià)[11，14]。

1.3.3 樣品中揮發(fā)性化合物的分析 樣品在40℃水浴鍋中用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附20 min后進(jìn)行固相微萃取頂空進(jìn)樣分析，解吸附時(shí)間為3 min，GC-MS分析條件參考文獻(xiàn)[13]。通過特征離子峰和保留指數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)品、揮發(fā)性化合物譜庫（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）以及參考文獻(xiàn)進(jìn)行對照后定性。其中，保留指數(shù) （RIx）借鑒Kratz和Vandendoo[14]方法進(jìn)行運(yùn)算。對于2-甲基呋喃和順式-3-己烯醇等27種具有對照標(biāo)準(zhǔn)品的成分，根據(jù)它們的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用外標(biāo)法進(jìn)行定量；其余10種沒有購買到對照標(biāo)準(zhǔn)品的成分通過內(nèi)標(biāo)環(huán)己酮標(biāo)準(zhǔn)曲線采用SIM模式（特征碎片為55）進(jìn)行相對定量分析。

1.3.4 揮發(fā)性成分香氣強(qiáng)度值的計(jì)算 香氣強(qiáng)度值（OAV）采用揮發(fā)性成分濃度除以該成分氣味閾值的方式計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

通過Excell 2013（微軟，美國）計(jì)算平均值。采用SPSS-IBM 19.0（IBM，美國）軟件進(jìn)行顯著性分析和主成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶處理對香氣感官特征的影響

如圖1所示，IGT以焦糖香和甜香為主，木香、花香及青草香較弱，此結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道的綠茶香氣特征（主要呈現(xiàn)青草香）不一致[15]，其原因是速溶茶粉加工過程中香氣成分發(fā)生了揮發(fā)、氧化及美拉德反應(yīng)[3]。相比IGT，GIGT的青草香及花香顯著增強(qiáng)，焦糖香顯著降低，整體香味以青草香、花香、甜香為主；LIGT與IGT相比，焦糖香顯著降低，但其他香氣感官強(qiáng)度沒有顯著變化，整體香氣以焦糖香和甜香為主；GLIGT的焦糖香是所有樣品中最低的，且青草香和花香是所有樣品中最強(qiáng)的，其整體風(fēng)味呈現(xiàn)出濃郁青草香和甜香以及顯著的花香。對酶處理前后速溶綠茶粉水溶液花香、青草香、甜香、木香和焦糖香進(jìn)行主成分分析，其結(jié)果如圖2所示。其中，主成分1（PC 1）代表63.86%的總變量值，其與甜香、花香、青草香和木香的感官強(qiáng)度數(shù)值呈正相關(guān)，而與焦糖香感官強(qiáng)度值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（圖2（a））。主成分2（PC 2）與木香、花香和焦糖香的感官評價(jià)數(shù)值呈現(xiàn)正相關(guān)，與甜香和青草香數(shù)值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，可解釋16.96%的總變量（圖2（a））。主成分散點(diǎn)圖顯示4種樣品的香氣特征可歸為兩類（圖2（b）），其中IGT與LIGT同屬一類，GIGT與GLIGT同屬一類，此結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶處理會(huì)導(dǎo)致速溶綠茶粉水溶液的整體香氣特征顯著變化，可將速溶綠茶粉水溶液的香氣由焦糖香為主轉(zhuǎn)變成以青草香和甜香為主。Zhu等人研究表明黑曲霉胞外酶處理速溶綠茶粉水溶液，可增強(qiáng)花香和發(fā)酵香，同時(shí)減弱青草香、木香和甜香減弱[10]；Ni等人研究發(fā)現(xiàn)用黑曲霉胞外酶處理綠茶水溶液，其烘烤香和蘑菇香增強(qiáng)，同時(shí)青草香、焦糖香和木香減弱[13]。這些相關(guān)研究與本研究結(jié)果顯著不同，其原因是相關(guān)研究采用的黑曲霉胞外粗酶液的的酶種類復(fù)雜，而作者采用了純化的β-葡萄糖苷酶及α-L-鼠李糖苷酶。

圖1 IGT、GIGT、LIGT和GLIGT感官評價(jià)雷達(dá)圖Fig.1 Radar map of the sensory evaluations of IGT、GIGT、LIGT and GLIGT

圖2 感官評價(jià)的主成分及得分散點(diǎn)圖Fig.2 Principal components and scatter plot of sensory evaluation scores

2.2 酶處理對揮發(fā)性成分組成的影響

采用GC-MS對速溶綠茶粉水溶液及其不同酶處理樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，得到總離子流圖（圖3），依據(jù)相似度檢索、特征離子碎片分析和標(biāo)準(zhǔn)品比對等方法進(jìn)行定性分析，共鑒定出37種揮發(fā)性成分（表1）。這些化合物包括3種呋喃類物質(zhì)、6種醛類物質(zhì)、4種醇類物質(zhì)、3種酯類物質(zhì)、3種酮類物質(zhì)、14種烯烴類物質(zhì)和4種其它物質(zhì)。

定量分析結(jié)果（表2）顯示，IGT的主要揮發(fā)性化合物為 3-甲基丁醛 （354.66 μg/L）、2-甲基丁醛（583.44 μg/L）、壬醛（219.46 μg/L）、2-乙基己基水楊酸（411.64 μg/L）、N-吡啶（994.08 μg/L）、2，6-二叔丁基對苯酚（2 135.05 μg/L），此結(jié)果與 Qin等人[16]報(bào)道的中國綠茶的主要揮發(fā)性化合物是正戊醛、正己醛、檸檬烯、苯甲醛、壬醛、α-萜品醇、水楊酸甲酯、香葉醇和橙花叔醇的結(jié)果以及Wu等人[17]報(bào)道的武夷綠茶特征香氣成分為芳樟醇、香葉醇、順式-茉莉酮、δ-杜松烯、依蘭烯、α-雪松烯和β-石竹烯的結(jié)果不成一致，主要原因是速溶茶粉在加工過程中發(fā)生氧化、縮合、聚合和基團(tuán)轉(zhuǎn)移等反應(yīng)[1，18]。

GIGT中共檢測出37種揮發(fā)性化合物，主要為2-甲基丁醛（404.52 μg/L）、壬醛（254.94 μg/L）、順式-3-己烯醇（3 443.81 μg/L）、香葉醇（1 803.23 μg/L）、δ-杜松烯 （392.11 μg/L）、α-去二氫菖蒲烯（4 10.61 μg/L）、2-乙基己基水楊酸 （577.69 μg/L）、2，6-二叔丁基對苯酚（3 673.16 μg/L）（表 2）。相比IGT中的揮發(fā)性化合物，GIGT中順式-3-己烯醇（0.00 vs 3 443.81 μg/L）、 香葉醇 （0.00 vs 1 803.23 μg/L）、 己醇 （ 0.00 vs 124.68 μg/L）、 水楊酸甲酯（0.00 vs 134.25 μg/L）、苯甲醛（0.00 vs 104.54 μg/L）、癸醛（0.00 vs 95.77 μg/L）、壬醛、2-十一酮、2-乙基己基水楊酸、α-去二氫菖蒲烯、δ-杜松烯、2，6-二叔丁基對苯酚和3，5-二甲基苯酚的含量顯著增加，但3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和N-吡啶的含量顯著減少。LIGT中共鑒定出32種揮發(fā)性化合物，相對于IGT，其癸醛（0.00 vs 122.05 μg/L）、壬醛（219.46 vs 351.0 μg/L）、2-乙基己基水楊酸 （411.64 vs 674.55 μg/L）等含量顯著增加。GLIGT中鑒定出37種揮發(fā)性化合物，其主要揮發(fā)性化合物與GIGT中一致，但順式-3-己烯醇（3 443.81 vs 4 017.11 μg/L）、水楊酸甲酯 （134.25 vs 172.66 μg/L）、 壬醛 （254.94 vs 290.6 μg/L）、癸醛（95.77 vs 122.05 μg/L）和 2-十一酮（127.86 vs 256.41 μg/L）、2，6-二叔丁基對苯酚（3 673.16 vs 4 490.56 μg/L）含量進(jìn)一步提高。以上結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶可顯著增加速溶綠茶粉水溶液中多種揮發(fā)性成分的含量，α-L-鼠李糖苷酶也可以增加一些揮發(fā)性成分的含量，且它們對速溶綠茶粉水溶液的揮發(fā)性成分的增加存在協(xié)同增效作用。

根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，β-葡萄糖苷酶處理可顯著增加綠茶湯中順式-3-己烯醇、水楊酸甲酯和芳香族醇含量[12]；漆酶和α-半乳糖苷酶處理可顯著增加綠茶溶液中壬醛含量[19]。作者用β-葡萄糖苷酶處理速溶綠茶粉水溶液，該結(jié)果與其他學(xué)者相關(guān)研究結(jié)果相似。此外，本研究發(fā)現(xiàn)α-L-鼠李糖苷酶也能增加速溶綠茶粉水溶液的揮發(fā)性物質(zhì)成分，同時(shí)α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶在增加速溶綠茶粉揮發(fā)性成分方面具有協(xié)同增效作用；這兩方面的尚未見同類研究報(bào)道。

圖 3 IGT、GIGT、LIGT、GLIGT、β-葡萄糖苷酶和 α-L-鼠李糖苷酶揮發(fā)性化合物總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram （TIC）of the volatiles in IGT，LIGT，GIGT，GLIGT，β-glucosidase and α-L-rhamnosidase solution

表1 IGT、GIGT、LIGT、GLIGT中揮發(fā)性成分的鑒定及標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Identification and standard curves of volatile compounds in IGT、GIGT、LIGT、GLIGT

續(xù)表1

表2 IGT、GIGT、LIGT、GLIGT中揮發(fā)性化合物定量表Table 2 Quantitative determination of volatile components of IGT、GIGT、LIGT、GLIGT

續(xù)表2

2.3 酶處理對揮發(fā)性成分氣味強(qiáng)度值（OVA）的影響

根據(jù)GC-MS檢測到的揮發(fā)性成分濃度和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的氣味閾值，計(jì)算各成分的OAV值，結(jié)果如表3所示。IGT中，3-甲基丁醛（OVA 1773.30）、2-甲基丁 醛 （OVA 583.44）、2-乙 基 呋 喃 （OVA 29.36）、檸檬烯（OVA 4.12）、壬醛（OVA 5.49）等成分的氣味強(qiáng)度達(dá)到了正常人體嗅覺可以感知的強(qiáng)度（OAV值大于1）。它們分別呈現(xiàn)出可可味、杏仁味、檸檬味和青草香[20-21]，這與IGT主要呈現(xiàn)出焦糖香和甜香相符合。

GIGT 中 3-甲基丁醛（OVA 1193.55）、2-甲基丁醛（OVA 404.52）、2-乙基呋喃（OVA 26.26）、順式-3-己烯醇（OVA 49.2）、檸檬烯（OVA 4.12）、壬醛（OVA 5.49）、 香葉醇 （OVA 45.05）、 水楊酸甲酯（OVA 3.36）和癸醛（OVA 1.6）的氣味強(qiáng)度可被正常人體嗅覺感知（OAV值大于1）（表3）。這些物質(zhì)分別呈現(xiàn)青草香、花香和甜香，該結(jié)果較好解釋了GIGT的香氣以青草香、花香、甜香為主。LIGT中3-甲 基 丁 醛 （OVA 1290.00）、2- 甲 基 丁 醛 （OVA 493.14）、2-乙基呋喃 （OVA 23.85）、 檸檬烯（OVA 4.17）、壬醛（OVA 8.78）等成分的 OAV 值大于 1，說明這些成分對其整體香氣特征具有影響。LIGT與IGT中各成分的OAV值十分相近，說明其主要?dú)馕敦暙I(xiàn)成分與IGT相比沒有發(fā)生顯著變化。GLIGT中3-甲基丁醛 （OAV 1166.90）、2-甲基丁醛（OAV 426.68）、2-乙基呋喃（OAV 23.44）、順式-3-己烯醇（OAV 57.39）、 檸檬 烯 （OAV 4.22）、 壬醛 （OAV 7.26）、香葉醇（OAV 40.53）、水楊酸甲酯（OAV 4.32）和癸醛（OAV 2.03）成分的OAV值大于1，說明這些成分對其整體香氣特征具有影響；該結(jié)果與GLIGT顯示出很強(qiáng)的青草香、花香和甜香相符合。另外，相對于GIGT來說，GLIGT中具有青草香的揮發(fā)性化合物的OAV值明顯增加，這就說明α-L-鼠李糖苷酶與β-葡萄糖苷在增強(qiáng)速溶綠茶粉水溶液青草香方面具有協(xié)同作用。

Ni等人通過GC-O實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑曲霉胞外粗酶可增加綠茶水溶液揮發(fā)性成分的氣味稀釋倍數(shù)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶可提高速溶綠茶粉水溶液青草香和花香成分香氣強(qiáng)度值，該結(jié)果與Ni等人的研究[13]相似。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)α-L-鼠李糖苷酶與β-葡萄糖苷對速溶綠茶粉水溶液青草香具有協(xié)同增強(qiáng)作用，該結(jié)果尚未見同類報(bào)道。

表3 IGT、GIGT、LIGT和GLIGT的香氣強(qiáng)度值Table 3 Odor activity values of IGT、GIGT、LIGT and GLIGT

3 結(jié)語

速溶綠茶粉水溶液主要呈現(xiàn)甜香與焦糖香。β-葡萄糖苷酶處理可顯著增強(qiáng)速溶綠茶粉水溶液的花香和青草香；α-L-鼠李糖苷酶處理可降低速溶綠茶粉水溶液的焦糖香；β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶對提高速溶綠茶粉水溶液的青草香具有協(xié)同增效作用。該研究為利用β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶提高茶飲料、茶糕點(diǎn)等產(chǎn)品的風(fēng)味提供了基礎(chǔ)。