重組蔗糖異構(gòu)酶在短短芽孢桿菌中的表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化

鄒 亮 ，吳 敬 ，陳 晟 *

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 教育部食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

蔗糖異構(gòu)酶 （EC5.4.99.11，Sucrose isomerase，SIase）能以蔗糖為底物生成異麥芽酮糖（6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖，isomaltulose）和海藻酮糖（1-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖，trehalulose）， 屬于糖苷水解酶13家族[1]。異麥芽酮糖在自然界中較少，主要存在于蜂蜜、甘蔗汁中，與蔗糖屬于同分異構(gòu)體，有著相似的物理性質(zhì)和特殊生理功能[2-5]，可以作為一種新型的食品添加劑應(yīng)用于面包、飲料、糖果等食品中。目前，異麥芽酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)主要通過蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖獲得。據(jù)文獻(xiàn)報道，來源于大黃歐文菌屬Erwinia rhapontici[6]、沙雷氏桿菌Serratia plymuthica[7-8]、腸桿菌屬（Enterobactersp）[9]、克雷伯氏菌屬 （Klebsiellasp）[10-11]、 分散泛菌屬（Pantoea dispersa）[12-13]等菌屬的蔗糖異構(gòu)酶都已成功進(jìn)行了異源表達(dá)，但由于表達(dá)量較低，仍無法滿足市場需求。

短短芽孢桿菌（Brevibacillus choshinensis）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）都屬于革蘭氏陽性菌，其細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，是非致病安全菌株，可以應(yīng)用于食品工業(yè)。由于其在芽孢桿菌屬中具有優(yōu)良的分泌功能，因而廣泛用于異源蛋白的表達(dá)，包括普魯蘭酶、α-淀粉酶、抗原片段、生長因子[14-16]等。目前短短芽孢桿菌主要通過穿梭載體pNCMO2表達(dá)胞外酶，穿梭載體pNCMO2上的P2啟動子是6種生理性外壁蛋白啟動子中的一種強(qiáng)啟動子，貫穿整個細(xì)胞生長時期，它是一種未知類型的啟動子，并可能參與外壁蛋白的合成與分泌，同時也控制著外源蛋白的表達(dá)。

作者以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組菌Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI為基礎(chǔ)，進(jìn)行了搖瓶和發(fā)酵罐的條件優(yōu)化。另外構(gòu)建了不同類型啟動子的重組短短芽孢桿菌工程菌以探索啟動子對蔗糖異構(gòu)酶胞外表達(dá)的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行了搖瓶和3 L發(fā)酵罐條件優(yōu)化。這些研究對工業(yè)化生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶有一定研究意義，同時也為短短芽孢桿菌表達(dá)其他異源蛋白提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌 （Escherichia coliJM109）、枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilisCCTCC NO：M2016536）和重組菌Brevibacillus choshinenssi/pNCMO2-SI、含有巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium木糖誘導(dǎo)型啟動子Pxyl/Bm的質(zhì)粒pSEVB：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；短短芽孢桿菌（Brevibacillus choshinensis）與穿梭質(zhì)粒 pNCMO2：購于寶生物生物工程有限公司。穿梭質(zhì)粒pNapr-SI、pNnpr-SI、pNamy-SI、pNxyl-SI：作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶（NdeⅠ、HindⅢ、PstⅠ等）、DNA 聚合酶 Primer Star、DNA marker ：購于寶生物生物工程有限公司；蛋白膠試劑盒與蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：購于碧云天技術(shù)研究所；質(zhì)粒小提試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：購于北京天根生化科技有限公司；其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純級。

1.1.3 主要儀器 UVP凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；DYY-6C型凝膠電泳儀：北京六一儀器有限公司產(chǎn)品；安捷倫1200型高效液相色譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；BECKMAN COULTER高速離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品；SBA-40C生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所產(chǎn)品；3 L全自動NBS發(fā)酵罐：美國NBS公司產(chǎn)品。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10；LB 固體培養(yǎng)基（g/L）：在 LB 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入1.8 g/dL的瓊脂；TM液體培養(yǎng)基（g/L）：多聚蛋白胨 10，牛肉粉 5，分子級酵母粉 2，葡萄糖（單獨(dú)滅菌）10，微量元素液（10 mL/L）；TM固體培養(yǎng)基（g/L）：在TM液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入1.8 g/dL的瓊脂；電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基SHC溶液（g/L）：甘油 150，蔗糖 100，HEPES 3.82，CaCl20.11；3 L 罐發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：多聚蛋白胨 8.5，牛肉浸膏 8.5，（NH4）2HPO40.5，KH2PO41，葡萄糖（單獨(dú)滅菌）；微量元素液10 mL/L；補(bǔ)料培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖100；微量元素液 （g/L）：FeSO4·7H2O 1.0 ，MnSO4·4H2O 1.0 ，ZnSO4·7H2O 0.1。

葡萄糖在115℃下，滅菌15 min，其他培養(yǎng)基均為121℃，滅菌15 min。另外根據(jù)具體情況，添加不同的抗生素：100 mg/L的氨芐青霉素或10 mg/L的硫酸新霉素。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng) 種子培養(yǎng)：從甘油管中以體積分?jǐn)?shù)2%接種體積分?jǐn)?shù)接種到裝液量為10 mL TM培養(yǎng)基的三角瓶中，加入終質(zhì)量濃度為30 mg/L的硫酸新霉素，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12～14 h。

搖瓶發(fā)酵：從種子液中吸取2.5 mL接種到裝液量為50 mL TM培養(yǎng)基的三角瓶中，加入終質(zhì)量濃度為10 mg/L的硫酸新霉素，在30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h。待發(fā)酵完成后，將菌液離心并收集上清液，上清即為蔗糖異構(gòu)酶粗酶液。

1.2.2 重組菌在3 L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子液按照10%的接種體積分?jǐn)?shù)，接種到裝有1 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L NBS發(fā)酵罐中，同時加入質(zhì)量濃度為10 g/L葡萄糖和10 μg/mL新霉素。在溫度為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min條件下進(jìn)行恒溫發(fā)酵。用2 mol/L硫酸和5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，及時測罐內(nèi)殘?zhí)?，?dāng)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度低于5 g/L時，開始流加葡萄糖，使其維持在恒定值。將攪拌轉(zhuǎn)速（300～700 r/min）與空氣流量（1～3 L/min）耦聯(lián)，使罐內(nèi)溶氧維持在30%。

1.2.3 帶有不同啟動子重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以質(zhì)粒pNapr-SI構(gòu)建為例，先以質(zhì)粒pNCMO2-SI為模板，用引物pNC-F/pNC-R進(jìn)行去除P2啟動子的基因片段，再以枯草芽孢桿菌B.subtilisCCTCC NO：M2016536基因組為模板，用引物Apr-F/Apr-R菌落PCR克隆出啟動子Apr-E基因片段，分別進(jìn)行膠回收及純化后，進(jìn)行酶連操作，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，在氨芐抗性平板上進(jìn)行篩選，挑單菌落到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證后送測序，與NCBI數(shù)據(jù)庫中Apr-E啟動子序列進(jìn)行比對，若無誤則表示質(zhì)粒pNapr-SI構(gòu)建成功。其他重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程類似。構(gòu)建重組質(zhì)粒所需引物見表1。

表1 引物Table 1 Primers’sequence

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化短短芽孢桿菌

1）感受態(tài)的制備 感受態(tài)細(xì)胞在TM培養(yǎng)基中37℃，200 r/min過夜培養(yǎng)，稀釋40倍后再在TM培養(yǎng)基中37℃200 r/min培養(yǎng)4～5 h，分裝至50 mL離心管在冰上冷卻10 min，在4℃、5 000 r/min條件下離心10 min，倒掉上清液。吸取SHC緩沖液輕輕吹吸菌液，在4℃、5 000 r/min條件下離心5 min，重復(fù)3～4次后加入體積比為1∶20的SHC緩沖液重懸浮菌體，每個EP管分裝200 μL菌液。

2）電轉(zhuǎn) 將上一步制備好的感受態(tài)細(xì)胞放入1 mm 電擊杯中，加入 10 μL 重組質(zhì)粒（100 ng/μL）和100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%PEG6000，冰上放置10 min后用一個單一的電脈沖場強(qiáng)為21 kV/cm進(jìn)行電擊，電擊完成后迅速加入TM培養(yǎng)基，并在37℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)2 h，在3 000 r/min條件下離心5 min，留100 μL菌液涂布于10 mg/L的硫酸新霉素的TM固體培養(yǎng)基中，過夜倒置培養(yǎng)。

1.2.5 重組菌的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化

1）氮源對不同啟動子重組菌的影響 在TM培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，分別選取魚粉蛋白胨、工業(yè)蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、安琪酵母粉為氮源（17 g/L），以葡萄糖為碳源，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

2）表面活性劑對不同啟動子重組菌的影響分別在培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%TWEEN20和2%PEG4000，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

1.2.6 細(xì)胞干重的測定 取5 mL發(fā)酵液，高速離心后棄上清，用生理鹽水洗滌兩遍后烘干稱重，得到菌體細(xì)胞干重（DCW），單位為g/L。

1.2.7 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 采用Bradford法測蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線用牛血清蛋白測定。

1.2.8 發(fā)酵罐內(nèi)殘?zhí)堑臏y定 采用SBA-40C生物傳感分析儀測定發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖質(zhì)量濃度。點(diǎn)擊“開始”清洗管路，用取樣針吸取25 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品，待綠燈常亮后表示校準(zhǔn)成功。將待測樣品稀釋到合適范圍后準(zhǔn)確吸取25 μL打入進(jìn)樣口，讀取數(shù)值。

1.2.9 發(fā)酵液中蔗糖異構(gòu)酶SDS-PAGE電泳 將發(fā)酵液在12 000 r/min，10 min離心處理后，棄沉淀，留上清。取發(fā)酵上清20 μL，加入5μL蛋白加樣緩沖液，煮沸處理10 min（同時處理蛋白分子marker）。參照聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒配制蛋白膠，分別取8 μL發(fā)酵上清和蛋白分子marker上樣。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色處理，多次脫色待電泳條帶清晰可見后在凝膠成像儀中觀看。

1.2.10 蔗糖異構(gòu)酶酶活的測定 用50 mmol/L、pH 6.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液將待測樣品稀釋到一定倍數(shù)后，吸取100 μL稀釋后的酶液到終質(zhì)量濃度為200 g/L蔗糖的上述緩沖液中。立即用旋渦振蕩儀混勻后，在30℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15 min，煮沸10 min滅酶。采用HPLC示差檢測器檢測樣品含量，其中包括底物蔗糖，產(chǎn)物異麥芽酮糖，副產(chǎn)物海藻酮糖、葡萄糖、果糖。

酶活單位（U）定義：在30℃，pH 6.0條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化蔗糖生成1 μmol異麥芽酮糖所需要的酶量定義為1 U。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶的研究

2.1.1 重組蔗糖異構(gòu)酶的搖瓶發(fā)酵 實(shí)驗(yàn)室前期將來源于Pantoea dispersa的蔗糖異構(gòu)酶基因與穿梭載體pNCMO2連接，構(gòu)建了重組菌Brevibacilluschoshinensis/pNCMO2-SI。從-80℃保藏的甘油管中以2%體積分?jǐn)?shù)接種，將重組菌接種到加有新霉素的TM培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min條件下將種子擴(kuò)大培養(yǎng)12 h，以5%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到優(yōu)化TM培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min條件下培養(yǎng)培養(yǎng)48 h后，用高速離心機(jī)離心，上清即為蔗糖異構(gòu)酶粗酶液，稀釋相應(yīng)倍數(shù)后測得胞外上清酶活為50 U/mL。蔗糖異構(gòu)酶發(fā)酵上清經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳顯示如圖1。

圖1 重組菌Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI在TM培養(yǎng)基中表達(dá)Fig.1 Production ofSIaseby recombinantstrain Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI in TM medium

2.1.2 重組蔗糖異構(gòu)酶的發(fā)酵罐條件優(yōu)化 在實(shí)驗(yàn)室前期基礎(chǔ)上確立了重組菌3 L發(fā)酵罐初始發(fā)酵條件為初始碳源10 g/L葡萄糖，初始氮源多聚蛋白胨、牛肉浸膏各8.5 g/L，30℃恒溫發(fā)酵的發(fā)酵工藝，初始pH為7.0，配制2 mol/L H2SO4和5 mol/L NaOH自動調(diào)節(jié)pH，整個發(fā)酵過程罐內(nèi)溶氧控制在體積分?jǐn)?shù)30%，通過控制通氣量和純氧使其達(dá)到以上水準(zhǔn)。依次分別對上罐時初始碳源質(zhì)量濃度，初始氮源質(zhì)量濃度以及發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化。

1）初始碳源對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響 重組菌在不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度時，其生長與產(chǎn)酶受到很大影響。碳源質(zhì)量濃度對重組菌產(chǎn)酶影響見圖2。相較于其他碳源質(zhì)量濃度，添加10 g/L葡萄糖時，酶活達(dá)到185 U/mL。碳源質(zhì)量濃度對重組菌生長情況影響如圖3所示，初始碳源質(zhì)量濃度越高時，重組菌生長得越好，但酶活并未隨著菌體增長而線性增長。由此選擇添加10 g/L葡萄糖作為初始碳源時最為合適。

2）初始氮源對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響 不同初始氮源質(zhì)量濃度對重組菌產(chǎn)酶影響見圖4。相較于其他氮源質(zhì)量濃度，添加30 g/L的初始氮源（多聚蛋白胨與牛肉浸膏各15 g/L）時酶活為260 U/mL。氮源質(zhì)量濃度對菌體生長情況影響見圖5。在發(fā)酵前期，初始氮源質(zhì)量濃度越高，菌體生長得更快。由此選擇添加30 g/L初始氮源最為合適。

圖2 初始碳源對重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects ofinitialcarbon sources on SIase production of recombinant strains

圖3 初始碳源對重組菌生長的影響Fig.3 Effects of initial carbon sources on the growth of recombinant strains

圖4 初始氮源對重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effectsofinitialnitrogen sourceson SIase production of recombinant strains

圖5 初始氮源對重組菌生長的影響Fig.5 Effects of initial nitrogen sources on the growth of recombinant strains

3）發(fā)酵溫度對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響 不同發(fā)酵溫度對重組菌產(chǎn)酶影響見圖6。從圖中可以看出，恒溫30℃發(fā)酵時酶活為275 U/mL，明顯高于其他溫度。不同發(fā)酵溫度對重組菌生長情況影響見圖7。發(fā)酵溫度過高或過低時，未達(dá)到菌株的最佳產(chǎn)酶溫度，因而酶活較低。由此選擇30℃恒溫發(fā)酵最為合適。

圖6 發(fā)酵溫度對重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of fermentation temperature on SIase production of recombinant strains

圖7 發(fā)酵溫度對重組菌生長的影響Fig.7 Effects of fermentation temperature on the growthof recombinant strains

2.2 不同啟動子重組菌株的構(gòu)建、表達(dá)與發(fā)酵優(yōu)化

2.2.1 不同啟動子的篩選 不同啟動子對異源蛋白的表達(dá)效果不一，因而篩選啟動子尤為重要。目前，在短短芽孢桿菌為宿主的表達(dá)系統(tǒng)中，國內(nèi)外主要使用來源于短短芽孢桿菌自身的啟動子，而較少研究其他來源的啟動子。作者選取了來源于枯草芽孢桿菌的組成型啟動子Papr-E，Pnpr-E，Pamy以及來源于巨大芽孢桿菌的誘導(dǎo)型啟動子Pxyl。構(gòu)建不同啟動子的重組質(zhì)粒分別為pNapr-SI、pNnpr-SI、pNamy-SI、pNxyl-SI， 分別轉(zhuǎn)化進(jìn)短短芽孢桿菌后命名為 BCpNapr-SI、BCpNnpr-SI、BCpNamy-SI、BCpNxyl-SI。經(jīng)過TM培養(yǎng)基發(fā)酵48 h后，離心取胞外上清稀釋一定倍數(shù)測得酶活如圖8所示。

圖8 重組菌株在TM培養(yǎng)基中的發(fā)酵情況Fig.8 Fermentation conditions of recombinant strains in TM medium

通過圖可以看出，組成型啟動子（Papr、Pnpr、Pamy）表達(dá)量明顯高于誘導(dǎo)型啟動子（Pxyl），其中，重組菌株BCpNapr-SI所測酶活最高，為85.1 U/mL，高于其他啟動子表達(dá)量。

2.2.2 重組菌株搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化 為進(jìn)一步提高上述菌株的產(chǎn)酶能力，作者對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，前期研究表明碳源為10 g/L葡萄糖效果較好，在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)主要對不同重組菌株的氮源和添加劑進(jìn)行了優(yōu)化。

不同氮源對重組菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果影響見圖9。從圖中可以看出，氮源為魚粉蛋白胨或牛肉浸膏時， 重組菌株 BCpNapr-SI、BCpNamy-SI、BCpNxyl-SI的酶活較高；氮源為牛肉浸膏或安琪酵母粉時，重組菌株BCpNnpr-SI的酶活較高。其中氮源為魚粉蛋白胨時，重組菌株BCpNapr-SI的酶活最高，為127 U/mL，高于其他重組菌株。

添加劑對不同重組菌株發(fā)酵結(jié)果影響見圖10。通過圖可以看出，TWEEN 20對不同重組菌的表達(dá)都有明顯的促進(jìn)作用，其中對重組菌BCpNapr-SI的提高最為顯著，酶活為137 U/mL究其原因可能是TWEEN 20降低了目的蛋白與細(xì)胞膜之間的相互作用[20]。PEG4000對重組菌的表達(dá)效果不顯著。

圖9 氮源對不同重組菌株發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.9 Effects of nitrogen sources on the fermentation conditions of recombinant strains

圖10 添加劑對不同重組菌發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.10 Effects of additives on the fermentation conditions of recombinant strains

2.3 重組菌BCpNapr-SI 3 L發(fā)酵罐分析

圖11 重組菌株BCpNapr-SI在3 L發(fā)酵罐中產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶發(fā)酵結(jié)果Fig.1 Production of SIase in the recombinant strain BCpNapr-SI by fed-batch fermentation in a 3 L fermenter

通過搖瓶優(yōu)化培養(yǎng)基后，在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大試驗(yàn)分析。其發(fā)酵結(jié)果見圖11。圖中可以看出，重組菌在發(fā)酵20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，在發(fā)酵30 h后仍有緩慢的增長。隨著重組菌的生長，酶活亦隨之增長，酶活最高點(diǎn)出現(xiàn)在52 h處，為485.5 U/mL，是未優(yōu)化搖瓶酶活的5.7倍，是重組菌pNCMO2-SI上罐優(yōu)化后酶活的1.76倍。

3 結(jié) 語

在3 L發(fā)酵罐水平下進(jìn)行了初始碳源、初始氮源、溫度的優(yōu)化，優(yōu)化后胞外酶活為275 U/mL。

為進(jìn)一步研究不同啟動子對蔗糖異構(gòu)酶表達(dá)的影響，選取了來源于枯草芽孢桿菌的組成型啟動子Papr-E、Pnpr-E、Pamy以及來源于巨大芽孢桿菌中的誘導(dǎo)型啟動子Pxyl，構(gòu)建不同類型的重組菌后進(jìn)行了搖瓶優(yōu)化。用優(yōu)化后的條件對重組菌BCpNapr-SI進(jìn)行3 L發(fā)酵罐分析，在52 h時，胞外酶活最高，為485.5 U/mL。