LncRNA MEG3對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、侵襲及凋亡的影響

熊 璟，何元春，羅海林，李 強，黃河浪，黃錦飛

漢中市中心醫(yī)院 口腔科 (漢中 723000)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是人頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，在口腔癌中發(fā)病率最高，約占全部口腔惡性腫瘤的90%，易發(fā)生細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。目前，手術(shù)聯(lián)合放療、化療是治療OSCC的主要手段，盡管在診斷和治療方面取得了一定的進步，但患者生存質(zhì)量差、5年生存率只有40%～50%[2-3]。因此，研究OSCC的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制、尋找有效的治療靶點對防治OSCC具有重要的臨床意義。長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs, LncRNAs)是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，主要參與轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和蛋白功能調(diào)節(jié)等生物過程[4]。LncRNA能通過表觀遺傳修飾、RNA降解和翻譯后修飾等方式激活促癌基因或沉默抑癌基因，參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過程[5]。Tang等[6]實驗證明OSCC及其配對的癌旁組織中，多種LncRNA差異表達；進一步研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3在OSCC有較低的表達水平。但LncRNA MEG3對口腔鱗狀細胞癌的生物學(xué)功能的影響報道較少。本研究旨在探討LncRNA MEG3對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 病理組織樣本

選擇2016年3月至2018年3月期間在漢中市中心醫(yī)院確診為口腔鱗狀細胞癌的患者46例，其中男24例，女22例。納入標準：所有OSCC患者均經(jīng)手術(shù)后病理學(xué)檢查確認病灶性質(zhì)為鱗狀細胞癌；無其他臟器嚴重疾病、無口腔疾病史；術(shù)前均未接受過放療、化療及免疫治療；排除標準：伴有心、肝、脾、肺、腎等重要臟器損傷；治療過程中死亡；未簽署科研知情同意書患者。所有患者均在本院行“口腔鱗癌完整病灶切除術(shù)合并頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)”，術(shù)后收集患者癌組織作為研究組和患者口腔粘膜組織作為對照組。所有患者均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)倫理學(xué)委員會批準。

1.2 細胞與試劑

人口腔鱗狀細胞癌Tca8113細胞系及人正?？谇火つぜ毎礖OK均購自上海中科院細胞資源中心；含有胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國GIBCO 公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；引物及抗體購自上海生物工程有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；pcDNA3.1-載體購自上海艾博思生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織及細胞中LncRNA MEG3檢測 將組織或細胞勻漿后，根據(jù)試劑盒操作步驟，采用Trizol法提取組織或細胞總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。以cDNA模板進行PCR擴增，所有引物為LncRNA MEG3上游5'-ATCATCCGT CCACCTCCTTGTCTTC-3'，下游5'- GTATGAG CATAGCAAAGGTCAGGGC-3'；內(nèi)參β-actin上游5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。采用熒光定量PCR儀Mx3006P進行定量檢測。以β-actin為內(nèi)參，以 2-△△Ct計算LncRNA MEG3的相對表達量。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染 人口腔鱗狀細胞癌Tca8113細胞置于含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前1 d，將Tca8113細胞接種到6孔板上，待生長至80%時進行細胞轉(zhuǎn)染。將Tca8113細胞隨機分為3組，前兩組使用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染過表達pcDNA3.1-MEG3的質(zhì)粒(MEG3組)和空質(zhì)粒pcDNA3.1-NC (NC組)，轉(zhuǎn)染濃度為300 nmol/孔；空白對照組(BLANK組)加入PBS。轉(zhuǎn)染48 h后，qPCR檢測3組LncRNA MEG3表達，方法參照1.3.1。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞消化成單細胞懸液，以2×103/孔將細胞種植于96孔板上(每孔200 μL)，分別于0、24、48、72 h時加入CCK-8溶液(每孔20 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，于450 nm處用酶標儀檢測吸光度(OD)值。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后加入binding buffer (500 μL)，再分別加入Annexin V-FITC和Propidium lodide各5 μL混勻，避光室溫染色30 min，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.5 細胞侵襲實驗 細胞培養(yǎng)至生長對數(shù)期后，重新懸浮于無血清培養(yǎng)基中，以每孔 1×104個細胞密度接種于Transwell 小室內(nèi)，然后將小室移入6孔板內(nèi)，在小室下層孔中添加含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液1 mL，置入37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，拭去上室表面細胞及Matirgel，使用甲醛固定，結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下計數(shù)5個單獨視野的染色細胞數(shù)，取平均值作為評價其侵襲能力的指標。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LncRNA MEG3在OSCC組織和細胞系中的表達

qPCR檢測結(jié)果顯示，與正?？谇火つそM織和HOK細胞組相比，OSCC組織和Tca8113細胞中LncRNA MEG3表達水平明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示OSCC組織和細胞中LncRNA MEG3低表達(圖1)。

圖1 LncRNA MEG3癌組織及Tca8113細胞中的表達情況注：與口腔黏膜組織/細胞組相比較，*P<0.05

2.2 LncRNA MEG3細胞轉(zhuǎn)染效果

細胞轉(zhuǎn)染48 h后，PCR檢測LncRNA MEG3轉(zhuǎn)染效果發(fā)現(xiàn)，過表達MEG3組LncRNA MEG3的表達水平明顯高于NC組和BLANK組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明轉(zhuǎn)染成功(圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組細胞LncRNA MEG3的表達注：與對照組/NC組相比較，*P<0.05

2.3 過表達LncRNA MEG3對細胞增殖的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)24、48 和72 h后，LncRNA MEG3過表達組OD值明顯低于對照組和NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達LncRNA MEG3能夠抑制癌細胞增殖(圖3)。

圖3 過表達LncRNA MEG3對細胞增殖的影響注：與對照組/NC組相比較，*P<0.05

2.4 過表達LncRNA MEG3對細胞凋亡率的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)48 h后，LncRNA MEG3過表達組細胞凋亡率明顯高于對照組和NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達LncRNA MEG3能夠促進癌細胞凋亡(圖4)。

圖4過表達LncRNAMEG3對細胞凋亡的影響
注：與對照組/NC組相比較，*P<0.05

2.5 過表達LncRNA MEG3對細胞侵襲的影響

細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)48 h后，LncRNA MEG3過表達組細胞數(shù)明顯低于對照組和NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達LncRNA MEG3能夠抑制癌細胞侵襲(圖5)。

圖5 過表達LncRNA MEG3對細胞侵襲能力的影響注：與對照組/NC組相比較，*P<0.05

3 討論

LncRNA母細胞表達基因3(MEG3)位于人類染色體14q32.3位點，是一個全長約為1 700個核苷酸的母源性印記基因，同時也是第一個被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制作用的LncRNA[7]。LncRNA MEG3在許多正常組織中高表達，而在包括肺癌[8]、鼻咽癌[9]、卵巢癌[10]等多種腫瘤組織中低表達甚至不表達，且其表達異常和紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及患者不良預(yù)后密切相關(guān)。MEG3啟動子或基因間差異甲基化區(qū)域的超甲基化可能是導(dǎo)致腫瘤細胞中MEG3低表達或表達丟失的主要原因[11]。Jia等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3在舌癌組織樣本和SCC-15、CAL-27細胞系中表達減少。研究[6]表明，與正常的癌旁組織相比，LncRNA MEG3在口腔鱗狀細胞癌組織中表達水平明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗狀細胞癌組織及Tca8113細胞系中LncRNA MEG3的表達明顯降低，提示LncRNA MEG3可能是OSCC的一個潛在獨立的診斷標志。

腫瘤已經(jīng)成為嚴重威脅人類生命健康的主要疾病之一，探索新的、更早期的診斷標記物和治療靶點尤為重要。LncRNA是不編碼蛋白質(zhì)的RNA，具有調(diào)控細胞活動的功能，且功能越是復(fù)雜的真核生物，LncRNA在基因組中占比越高，人類基因組LncRNA的占比約為98.5%[13]。研究[14]證實LncRNAs在不同分期和組織學(xué)分級腫瘤中的表達存在差異，在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物行為中扮演重要角色。研究[15]表明，LncRNA的表達水平與舌鱗癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況密切相關(guān)，證實了LncRNA的異常表達與舌鱗癌的生物活性相關(guān)。在多種腫瘤細胞中過表達LncRNA MEG3能夠抑制腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展。詹艷萍等[10]研究表明，LncRNA MEG3可通過負性調(diào)控激活SK-VO-3細胞自噬從而抑制卵巢上皮癌。劉珂等[16]的研究結(jié)果顯示，過表達MEG3可抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲，促進凋亡。本研究選擇口腔鱗狀細胞癌Tca8113細胞系作為細胞模型，將重組的pcDNA3.1-MEG3轉(zhuǎn)染Tca8113細胞，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MEG3的OSCC細胞中MEG3表達增多，說明轉(zhuǎn)染成功。然后通過CCK-8、流式細胞術(shù)和Transwell檢測發(fā)現(xiàn)，過表達MEG3可明顯抑制Tca8113細胞的增殖和侵襲，增加細胞凋亡率，但其具體機制尚未明確。研究[17]結(jié)果顯示，MEG3可通過調(diào)控miRNA的表達水平參與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展。另有研究[18]表明，MEG3可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)信號通路影響腫瘤的進展，如Wnt/β-catenin、p53通路、DNA甲基化、pRb通路和Notch通路等。

綜上所述，本研究證實了LncRNA MEG3在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞中表達降低，過表達LncRNA MEG3能夠抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、侵襲和凋亡，可作為OSCC治療的潛在靶點，但LncRNA MEG3發(fā)揮作用的機制還有待深入研究。