北京市腹瀉兒童人博卡病毒VP1區(qū)基因特征分析

吉彥莉，王永全，崔海洋，靳 博

感染性腹瀉是全球兒童常見傳染病，是5歲以下兒童死亡的第二大原因。在我國，感染性腹瀉的發(fā)病率一直位居腸道傳染病的首位，疾病負擔(dān)嚴重[1-3]，已納入《中華人民共和國傳染病防治法》管理。研究表明，病毒是引起嬰幼兒感染性腹瀉的最主要原因，其中，諾如病毒、輪狀病毒、腸道腺病毒和星狀病毒是4種最常見的致瀉病毒[4-5]，同時也是病毒性腹瀉常規(guī)監(jiān)測項目。但是，仍有近50%的兒童急性腹瀉病原不明確[6-8]。

人博卡病毒（human bocavirus,HBoV）是瑞典學(xué)者Allander于2005年發(fā)現(xiàn)的一種細小病毒[9]，是單正鏈無包膜DNA病毒，基因組全長約5.6 kb，目前共發(fā)現(xiàn)4種型別（HBoV1～4型）。因HBoV在急性腹瀉糞便中頻繁檢出[10-12]，引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，多項病例對照研究都證明了其與腹瀉的相關(guān)性[13-14]。作為一種新發(fā)腹瀉相關(guān)病毒，

HBoV尚未被納入常規(guī)腹瀉病原學(xué)監(jiān)測，相關(guān)研究在我國亦不多見。本研究通過對北京地區(qū)急性腹瀉兒童HBoV的感染狀況及基因進化特征的研究，為兒童病毒性腹瀉的防控提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源 2015年11月 2016年12月，采集哨點醫(yī)院（北京大學(xué)第一醫(yī)院、北京市兒童醫(yī)院）門診就診的急性腹瀉兒童糞便標本。患兒年齡＜5歲，發(fā)病時間＜3 d，就診主訴為嘔吐或腹瀉等消化道癥狀。

1.2 標本前處理 將糞便標本與PBS充分震蕩混勻，制成10%的糞便懸液，8000 rpm離心5 min，取上清液備用。

1.3 HBoV檢測 用QIAamp? MinElute Virus Spin Kit（Qiagen）提取病毒核酸，通過巢式PCR擴增HBoV VP1區(qū)部分序列，引物序列見表1，反應(yīng)條件參照文獻[13]。目的片段條帶為567 bp，用QIAxcel Advanced毛細管電泳進行檢測。PCR陽性產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行純化回收及序列測定。

1.4 HBoV進化分析 將測序結(jié)果通過 BLAST比對確定病毒型別。下載Genbank中不同型別和亞型、不同地域及不同時間分布的HBoV序列，作為參考序列。用 Vector NTI AlignX計算毒株間序列相似性。用MEGA7進行序列和進化分析，用鄰接法構(gòu)建進化樹，用Kimura雙參數(shù)模型計算遺傳距離。

表1 HBoV巢式PCR引物Table 1 Nested PCR primers for HBoV

2 結(jié) 果

2.1 腹瀉兒童基本情況 2015年11月 2016年12月，共收集到396例5歲以下腹瀉兒童糞便標本?；純褐?，男223例，女173例，男女比例為1.29∶1。患兒最大月齡58個月，最小為0個月，月齡中位數(shù)為12個月。

2.2 HBoV的檢出情況 共檢出HBoV 30例，總檢出率為7.58%。其中，HBoV1型檢出17例，檢出率為4.29%；HBoV2型檢出11例，檢出率為2.78%；HBoV3型檢出2例，檢出率為0.51%，未檢出HBoV4型。

2.3 HBoV序列分析 將30例HBoV北京株（基因型別為：HBoV1、HBoV2及HBoV3）VP1區(qū)序列與Genbank中的序列進行BLAST比對。序列分析顯示30例HBoV北京株在VP1區(qū)核苷酸序列相似性為71%～100%，氨基酸序列相似性為85%～100%。其中，17例HBoV1北京株序列相似性為96%～100%，與HBoV1參考序列相似性為98%～99%；11例HBoV2北京株序列之間相似性為96%～100%，與HBoV2參考序列相似性為91%～99%；2例HBoV3北京株序列相似性為99%，與HBoV3參考序列相似性為97%～98%。

2.4 HBoV分子進化分析 系統(tǒng)進化樹顯示，HBoV包括4個進化樹分支，分別為HBoV1、HBoV2、HBoV3和HBoV4。本研究中的所有序列均位于HBoV1～3型分支上（圖1）。其中，HBoV1型北京株分支包括兩簇：BJ16-325自成一簇，與其他HBoV1型序列差異達4%；其余HBoV1型序列高度同源（相似性為98%～99%），共同構(gòu)成一簇。HBoV1 VP1區(qū)氨基酸序列比對分析也表明，BJ16-325與其他HBoV1型北京株相比，氨基酸特異變化位點最多，為4個（圖2），表明BJ16-325出現(xiàn)了較高程度的變異。

既往國內(nèi)外報道將HBoV2分型為HBoV2A和HBoV2B 2個亞型。而本研究顯示，HBoV2型序列在進化樹上包括3個亞型分支（bootstrap＞90），本研究中所有HBoV2型北京株序列均獨立于HBoV2A和HBoV2B亞型，位于一個新的亞型分支上。同源性分析表明，本研究中的HBoV2型北京株與HBoV2A、HBoV2B亞型間相似性分別為91%～93%及92%～93%，低于HBoV2A和HBoV2B亞型間的相似性（95%～96%）。此外，通過kimura-2-parameter模型計算遺傳距離發(fā)現(xiàn)，該HBoV2北京株序列與HBoV2A、HBoV2B亞型參考序列間平均遺傳距離分別為0.079和0.081，均高于2A與2B亞型之間的平均遺傳距離（0.045），由此表明該HBoV2型北京株序列為HBoV2的一個新的亞型。

圖1 北京地區(qū)HBoV生物進化樹Figure 1 Phylogenetic tree of HBoV in Beijing

3 討 論

嬰幼兒是急性感染性腹瀉的高發(fā)人群，發(fā)病率和病死率高，是值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。2005年Allander首次發(fā)現(xiàn)了HBoV，之后不斷有學(xué)者從腹瀉糞便中檢出HBoV。本研究顯示，北京地區(qū)5歲以下急性腹瀉兒童HBoV檢出率為7.58%，與重慶、上海等地結(jié)果相似[15-16]。因時間、地域、人群免疫力及檢測方法等不同，HBoV檢出率可出現(xiàn)較大差別[17-18]。

圖2 HBoV1北京株VP1區(qū)部分氨基酸序列比對Figure 2 Amino acid sequence alignment of partial VP1 region of HBoV1 Beijing strains

HBoV包括HBoV1～4 4種基因型，其中HBoV3型和HBoV4型檢出率低，較為少見。本研究中檢出的HBoV北京株包括HBoV1、HBoV2和HBoV3 3種型別。從進化樹上可以看到，北京地區(qū)的1株HBoV1序列BJ16-325在進化樹上自成一簇，且與HBoV1其他序列變異程度相對較大，差異達4%。而Zhao等[19]對當?shù)剡B續(xù)8年腹瀉病例HBoV的進化研究表明：HBoV1在VP1區(qū)高度保守，8年間所有HBoV1毒株在VP1區(qū)的變異僅為1%。這表明北京地區(qū)至少存在2組不同來源HBoV1毒株的流行。此外，值得注意的是，以往國內(nèi)外報道將HBoV2分為HBoV2A和HBoV2B 2個亞型。而本研究中檢出的所有北京地區(qū)HBoV2序列均不屬于HBoV2A和HBoV2B亞型，而是位于一個新的HBoV2亞型分支上，表明北京地區(qū)HBoV2流行株為近年來出現(xiàn)的一種新的亞型。

有研究表明，HBoV存在型間重組[20]，Zhao等[19]報道了HBoV2A和HBoV2B存在亞型間重組。病毒序列重組可導(dǎo)致新的型別及亞型的出現(xiàn)，還可能導(dǎo)致病毒毒力及抗原性的改變。本研究中，北京地區(qū)流行的HBoV2毒株為一個新的亞型，其是否來源于HBoV序列的重組變異還須要進一步研究。