黃刺玫果總黃酮的水提取工藝

陳明文，郝曉倩，楊官娥，王進(jìn)東

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原030001； 2.山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西太原030006）

黃刺玫是野生落葉灌木，屬于薔薇科薔薇屬植物［1］，別名黃刺梅，廣泛分布在我國北方的山區(qū)和丘陵地帶［2］，山西省境內(nèi)資源豐富。黃刺玫的花、果、葉和根皮均可入藥，能治療消化不良、腹痛腹脹或婦女月經(jīng)不調(diào)，具有健脾養(yǎng)血、理氣調(diào)經(jīng)的功效［1］?，F(xiàn)代研究表明，黃刺玫果實(shí)中含有豐富的黃酮、皂苷和植物SOD以及大量的微量元素和維生素［3］。黃刺玫果汁具有抗衰老和預(yù)防心血管病變的作用，機(jī)制和其對(duì)活性氧清除作用的加強(qiáng)以及減輕或阻斷脂質(zhì)過氧化作用相關(guān)［4］。毒理實(shí)驗(yàn)證明，黃刺玫安全無毒，黃刺玫果肉可作為天然抗氧化劑［5］，可作為藥用或食用資源［6］。對(duì)于黃刺玫果已有少量相關(guān)藥理研究報(bào)道，暫未見工業(yè)生產(chǎn)條件下的提取工藝報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究黃刺玫果中總黃酮提取的最佳工藝條件，采用紫外分光光度法測(cè)定黃刺玫果總黃酮的含量，為工業(yè)上大規(guī)模提取黃刺玫果中總黃酮提供依據(jù)和參考。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃刺玫果采自山西山區(qū)，經(jīng)單位阮文輝老師檢測(cè)為黃刺玫果Rosa xanthina Lindle，粉碎過50目篩。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量 HPLC：90.5%）購自中國藥品生物制品檢定所（批號(hào)：100080-200707）；無水乙醇、檸檬酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純；蒸餾水，自制。

1.2 儀器與設(shè)備

UV757CRT型紫外-分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；FA2104S型電子天平，廣州予華儀器有限公司；CHH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；RE-2000B型低溫冷卻循環(huán)泵和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，杭州瑞佳精密科學(xué)儀器有限公司；LYNX6000型高速冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按照藥典中亞硝酸鈉-硝酸鋁法，以蘆丁為對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。

精密稱取蘆丁對(duì)照品20.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液備用。以不加蘆丁對(duì)照品溶液的容量瓶為對(duì)照，精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL，3.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇至總體積為6.0 mL，分別再加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置 6.0 min；分別再加入 10%硝酸鋁溶液 1 mL，搖勻，放置 6.0 min；分別加入 1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，加入30%乙醇至刻度，放置15 min。在510 nm波長處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程A=12.92C-0.009，R2為 0.999 8，在 8 g/mL～96 g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 黃刺玫果總黃酮的提取和測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取粉碎成粗粉的黃刺玫干果50.0 g，置于1000 mL圓底燒瓶中，按一定料液比加入蒸餾水浸泡1.0 h，放入70℃恒溫水浴鍋中回流提取一定時(shí)間，提取一定次數(shù)，合并提取液后定容到一定體積，搖勻，作為樣品溶液。

2.2.2 樣品中總黃酮的測(cè)定 精密吸取供試品溶液1.0 mL，按照藥典中亞硝酸鈉-硝酸鋁法規(guī)定的前處理方法處理后進(jìn)行紫外測(cè)定，得到含量后按下式計(jì)算相應(yīng)的總黃酮得率（mg/g）。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取效果的影響 設(shè)定浸泡時(shí)間為 1.0 h，料液比 1∶8，提取溫度為 70 ℃，提取時(shí)間為1.0 h，pH為7.0的條件下，考察提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取效果的影響。即對(duì)單次水提取后抽濾得到的提取液進(jìn)行含量測(cè)定，重復(fù)提取5次，比較這5份提取液中總黃酮含量的差異情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)重復(fù)提取次數(shù)為4次時(shí)，總黃酮得率已經(jīng)很小，且繼續(xù)增加提取次數(shù)，已經(jīng)不能明顯增加黃刺玫果總黃酮的提取效果。綜合時(shí)間和效果方面考慮，最終確定重復(fù)提取3次為最適提取次數(shù)。結(jié)果見圖1。

圖1 提取次數(shù)對(duì)黃刺玫果總黃酮提取效果的影響

2.3.2 料液比對(duì)總黃酮提取效果的影響 設(shè)定浸泡時(shí)間為1.0 h，提取次數(shù)為3次，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為1.0 h，pH為7.0的條件下，考察料液比對(duì)黃刺玫總黃酮提取效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，料液比為1∶10時(shí)，總黃酮的提取效果較好。考慮到料液比過大帶來的經(jīng)濟(jì)問題和后續(xù)處理因素，選擇料液比為1∶10。結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)總黃酮提取效果的影響

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取效果的影響 設(shè)定浸泡時(shí)間為 1.0 h，料液比為 1∶10，提取溫度為 70 ℃，提取次數(shù)為3次，pH為7.0的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨意增加提取時(shí)間，提取時(shí)間為1.5 h后，總黃酮提取效果未見明顯增加，故選擇提取時(shí)間為1.5 h。結(jié)果見圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)總黃酮提取效果的影響

2.3.4 溫度對(duì)總黃酮提取效果的影響 設(shè)定浸泡時(shí)間為 1.0 h，料液比為 1∶10，提取次數(shù)為 3 次，提取時(shí)間為1.5 h，pH為7.0的條件下，考察提取溫度對(duì)總黃酮提取效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著提取溫度的升高，總黃酮的提取效果增加，提取溫度為80℃時(shí)，總黃酮提取效果最好。結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對(duì)總黃酮提取效果的影響

2.3.5 pH對(duì)總黃酮提取效果的影響 設(shè)定浸泡時(shí)間為 1.0 h，料液比為 1∶10，提取溫度為 80 ℃，提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)為3次的條件下，考察pH對(duì)總黃酮效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著pH的增加，黃刺玫果總黃酮提取效果先增加后減少。故選擇pH為3.0作為水提取的pH條件。

圖5 pH對(duì)總黃酮提取效果的影響

2.3.6 浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮提取效果的影響 設(shè)定提取次數(shù)為3次，料液比為1∶10，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為 1.5 h，pH 為 3.0 的條件下，考察浸泡時(shí)間對(duì)黃刺玫果總黃酮提取效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，浸泡時(shí)間大于1.5 h后并不明顯增加總黃酮得率，所以選擇浸泡時(shí)間1.5 h作為提取條件。結(jié)果見圖6。

3 正交試驗(yàn)

3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖6 浸泡時(shí)間對(duì)黃刺玫總黃酮提取效果的影響

在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合參考文獻(xiàn)［7-10］，在選定pH為3.0、提取次數(shù)為3次的前提條件下，考察提取溫度A、料液比B、提取時(shí)間C作為正交試驗(yàn)因素，每個(gè)因素如表1所示設(shè)置3水平，按照L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，以總黃酮得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)黃刺玫果中總黃酮的水提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果見表1。

表1 黃刺玫果總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

結(jié)果見表2。

表2 黃刺玫果總黃酮的提取L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由單因素試驗(yàn)和表2的正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響水提總黃酮的最主要因素是溫度，其次是料液比?？紤]到在溫度提升及料液比增加的情況下，相應(yīng)的成本和濃縮提取液的相關(guān)問題，結(jié)合總黃酮得率的相應(yīng)差距，最終確定了黃刺玫果總黃酮的提取工藝為A2B2C2，也就是在pH為3.0的水中按1∶10的料液比在80℃的條件下進(jìn)行提取，每次提取1.5 h，重復(fù)提取3次，總黃酮得率較高，成本合理。此工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在該提取工藝條件下，總黃酮平均得率為9.39 mg/g，對(duì)比葉松華等［7］的醇提黃刺玫果中總黃酮的工藝，用醇提法得到的總黃酮率為10.32 mg/g，兩者相比無明顯差異，考慮到工業(yè)上用醇提法可能存在的安全性以及液體回收和損耗的相應(yīng)成本，故而水提法在工業(yè)生產(chǎn)上能帶來更好的經(jīng)濟(jì)效益。

本實(shí)驗(yàn)得到了水提黃刺玫總黃酮的工藝條件為：浸泡時(shí)間1.5 h，料液比為 1∶10，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為 1.5 h，提取次數(shù)為 3 次，pH 為 3.0，總黃酮得率9.39 mg/g，具有可行性。為工業(yè)化提取黃刺玫果總黃酮提供了參考。