黃芪甲苷通過抑制血小板源性生長因子表達減輕大鼠頸動脈球囊損傷后內(nèi)膜增生

尉希清 劉帥 牛珩 胡玲愛 張金國

(濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科 山東省心臟疾病診療重點實驗室，山東 濟寧 272129)

冠心病(CHD)具有較高的致死率和致殘率，嚴重危害患者的生命健康〔1〕。近年來經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)(PCI)已成為CHD患者最有效的治療方法之一〔2〕。但支架內(nèi)再狹窄(ISR)已成為CHD PCI治療的瓶頸問題，因此探索有效的解決ISR的方法成為目前介入心臟病學的研究熱點之一。ISR的發(fā)病機制主要包括內(nèi)膜增生、血管重塑、彈性回縮，其中以內(nèi)膜增生最為重要〔3〕。我們課題組既往研究表明黃芪甲苷(ASTⅣ)可抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導的血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖、遷移〔4〕，ASTⅣ還能抑制球囊損傷大鼠頸動脈內(nèi)膜的增生〔5〕，但其具體機制尚不明確。本研究通過應用不同劑量的ASTⅣ干預半定量分析頸動脈內(nèi)膜血小板源性生長因子(PDGF)-BB及活性氧(ROS)的表達，探索ASTⅣ抑制頸動脈內(nèi)膜增生的具體機制。

1 材料及方法

1.1實驗材料

1.1.1主要實驗儀器 組織切片機、石蠟冷凍機、Leica石蠟包埋機、超薄切片機、冰凍切片機、組織展片烤片機(德國Leica公司)；電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器有限公司)；MoticBA600全自動掃描顯微鏡及照相系統(tǒng)(中國麥克奧迪公司)；Sunrise酶標儀(奧地利Tecan公司)；Image-proplus software5.0圖像分析軟件(美國 Media Cybernetics 公司)；2F Fogarty導管(美國 Edwards Lifescience 公司)；GENMED SCIENTIFICS INC.USA的細胞(ROS)超氧陰離子原位比色法定量檢測試劑盒(上海杰美基因公司)。

1.1.2主要試劑 3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)(武漢博士德生物工程有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ASTⅣ(純度98.34% 批號：121224，西安旭煌生物技術(shù)有限公司)；即用型鏈霉親和素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗鼠PDGF-BB一抗(Abcam公司)；兔抗鼠內(nèi)膜增殖細胞核抗原(PCNA)一抗(Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗：Santa Cruz公司)；

1.1.3實驗動物 50只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠用于構(gòu)建球囊損傷頸動脈內(nèi)膜模型，SPF級，購于山東濟寧魯抗藥業(yè)有限公司實驗動物中心。實驗動物許可證：SCXK-魯 20130001。實驗動物使用符合倫理學規(guī)范。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物的分組及處理方式 50只健康雄性成年SD大鼠隨機分成五組：模型組、ASTⅣ〔20 mg/(kg·d)〕組、ASTⅣ〔40 mg/(kg·d)〕組、ASTⅣ〔60 mg/(kg·d)〕組和假手術(shù)組各10例。假手術(shù)組(n=10)：只結(jié)扎左頸外動脈,用等劑量的清水灌胃，而不插入球囊；頸動脈球囊損傷模型組(n=10)：插入頸動脈球囊造成頸動脈內(nèi)膜損傷，給予等劑量清水灌胃，而不給任何藥物干預；ASTⅣ〔20 mg/(kg·d)〕組(n=10)：頸動脈球囊損傷+ASTⅣ〔20 mg/(kg·d)〕灌胃；ASTⅣ〔40 mg/(kg·d)〕組(n=10)：頸動脈球囊損傷+ASTⅣ〔40 mg/(kg·d)〕灌胃；ASTⅣ〔60 mg/(kg·d)〕組(n=10)：頸動脈球囊損傷+ASTⅣ〔60 mg/(kg·d)〕灌胃。實驗中大鼠頸動脈球囊損傷模型制作參照林志鴻等〔6〕的方法，ASTⅣ灌胃劑量參照相關(guān)文獻制定〔7〕。

1.2.2光鏡下觀察頸動脈管壁形態(tài)學 經(jīng)過蘇木素-伊紅(HE)染色的頸動脈管壁組織病理切片顯示，細胞核呈現(xiàn)藍色，細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色。在光學顯微鏡下，能夠觀察到頸動脈組織切片由平滑肌細胞和纖維結(jié)締組織構(gòu)成。內(nèi)膜位于內(nèi)彈力板以內(nèi)，外膜位于外彈力板以外，位于內(nèi)外彈力板之間的是中膜。在光學顯微鏡下放大100倍拍照保存。按照文獻描述的方法，應用Image-proplus software5.0圖像分析軟件，用鼠標分別構(gòu)畫出管腔輪廓和內(nèi)、外彈力板，用計算機分別計算管腔面積和內(nèi)、外彈力板各自的圍繞面積。并進一步計算內(nèi)膜面積(內(nèi)彈力板圍繞面積減去管腔面積)及內(nèi)膜面積/中膜面積比(外彈力板圍繞面積減去內(nèi)彈力板圍繞面積)。管腔面積、內(nèi)膜面積和內(nèi)膜面積/中膜面積比這三項指標能夠反映內(nèi)膜增生程度和血管狹窄程度。

1.2.3免疫組化染色 觀察血管壁PCNA和生長因子PDGF-BB的表達。

1.2.4血管壁ROS原位比色法定量測定 斷頸法處死大鼠后取頸總動脈約150 mg，將頸動脈條的脂肪組織在37℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)中除掉，將動脈條在4℃冰水中碾碎，以檢測頸動脈中ROS的含量：用200目濾網(wǎng)制作成頸動脈組織單細胞懸液，用pH7.4的PBS洗滌頸動脈組織2次，然后用1 500 r/min、4℃離心7 min，通過臺盼藍染色觀察頸動脈平滑肌細胞存活情況(顯示存活率≥95%)。將細胞濃度調(diào)節(jié)為106/ml；用96孔細胞培養(yǎng)板，每孔按分組各加入200 μl單細胞懸液，每組6個復孔，每孔加入Reagent A 20 μl到每個孔里，細胞培養(yǎng)板通過輕搖混勻，然后放到37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。吸出培養(yǎng)液，用PBS洗一次，各吸取Reagent B 100 μl固著液加到每一孔內(nèi)，輕震96孔板，將固著液小心抽去。再重復前一步驟2次，肉眼或顯微鏡觀察：細胞呈現(xiàn)藍黑色，代表ROS濃度增高。再吸取Reagent C 100 μl加到每一孔內(nèi)，輕搖培養(yǎng)板，等待GENMED溶解液分布均勻，常溫下孵育5 min后的細胞培養(yǎng)板即刻放進分光光度儀檢測，在波長650 nm各組細胞的OD值被檢測。然后構(gòu)建細胞內(nèi)ROS生成曲線：橫坐標為處理藥物及濃度；縱坐標為ROS吸光度值。

1.3統(tǒng)計學分析 應用SPSS13.0軟件行方差分析，組內(nèi)平均數(shù)的兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)學觀察ASTⅣ對大鼠頸動脈內(nèi)膜增生的影響 在放大100倍的光學顯微鏡下觀察到球囊損傷模型組大鼠頸動脈管腔明顯狹窄，內(nèi)膜增生、變厚；使用不同劑量的ASTⅣ干預，頸動脈內(nèi)膜增生顯示劑量依賴性漸減輕(見圖1)。在放大400倍的光學顯微鏡下觀察到球囊損傷模型組大鼠頸動脈內(nèi)膜的平滑肌細胞在靠近管腔側(cè)形態(tài)不規(guī)則，細胞體積明顯增大，排列紊亂，而且細胞核明顯變大?？拷鼉?nèi)彈力板側(cè)的平滑肌細胞核變小，排列緊密，證明ASTⅣ能夠劑量依賴性地抑制大鼠頸動脈內(nèi)膜增生(見圖2)。

模型組管腔面積、內(nèi)膜面積、內(nèi)膜/中膜比分別與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。ASTⅣ〔20 mg/(kg·d)〕、〔40 mg/(kg·d)〕和〔60 mg/(kg·d)〕都抑制了大鼠頸動脈內(nèi)膜的增生，ASTⅣ〔20 mg/(kg·d)〕、〔40 mg/(kg·d)〕、〔60 mg/(kg·d)〕組的內(nèi)膜面積、管腔面積、內(nèi)膜/中膜比分別與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，見表1。

圖1 頸總動脈球囊損傷14 d后各組血管壁形態(tài)觀察(HE染色，×100)

圖2 頸總動脈球囊損傷14 d后各組大鼠血管壁形態(tài)觀察(HE染色，×400)

組別n管腔面積(m2)內(nèi)膜面積(m2)內(nèi)膜/中膜比假手術(shù)組9113 311±10 2555 660±6 0330.15±0.22模型組922 345±11 2321)95 211±11 0231)1.77±0.121)ASTⅣ〔20 mg/(kg·d)〕組964 556±12 3322)51 511±1 1352)0.81±0.112)ASTⅣ〔40 mg/(kg·d)〕 組1074 666±10 9893)40 444±7 8773)0.66±0.163)ASTⅣ〔60 mg/(kg·d)〕 組999 000±11 2883)26 433±7 0333)0.45±0.113)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；3)P<0.01

2.2ASTⅣ對PCNA陽性表達的影響 普通光學顯微鏡下觀察，PCNA表達在平滑肌細胞的胞核中，陽性細胞核顯示棕色，假手術(shù)組PCNA表達量很低，陽性表達指數(shù)(3.88±1.50)%。而PCNA含量在模型組中顯著增高，陽性指數(shù)(75.68±8.50)%。低、中、高劑量ASTⅣ干預組的PCNA在內(nèi)膜中表達均降低，陽性指數(shù)分別為(60.68±9.55)%，(50.77±9.10)%，(40.68±9.50)%，分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

2.3ASTⅣ對頸動脈內(nèi)膜中PDGF-BB表達的影響 PDGF-BB在假手術(shù)組中少量表達，累積光密度為(0.33±0.10)。球囊損傷后大鼠頸動脈內(nèi)膜中PDGF-BB表達明顯增加。球囊損傷的模型組頸動脈內(nèi)膜中可觀察到大量表達的PDGF-BB，累積光密度為(0.78±0.15)，與假手術(shù)組比較，有顯著差異(P<0.01)。低、中、高劑量ASTⅣ干預組觀察到頸動脈內(nèi)膜PDGF-BB表達均降低，其累積光密度分別為(0.70±0.25)、(0.60±0.33)、(0.55±0.16)，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著ASTⅣ劑量增加，差異更顯著(見圖4)。

2.4各組大鼠頸總動脈中ROS含量的比較 假手術(shù)組頸總動脈ROS有少量表達，OD值(0.264±0.062)，大鼠頸動脈球囊損傷后的模型組ROS表達明顯增加，OD值(1.168±0.092)，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。ASTⅣ低、中、高劑量組大鼠頸總動脈ROS表達均下降，OD值分別為(0.984±0.088)、(0.782±0.075)、(0.328±0.071)，與模型組比較ROS產(chǎn)生明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。

圖3 球囊損傷頸總動脈14 d后PCNA在內(nèi)膜中的表達比較(免疫組化染色，×400)

圖4 各組大鼠頸總動脈內(nèi)膜中PDGF-BB表達的比較(免疫組化染色，×400)

3 討 論

PCI是目前CHD手術(shù)治療的有效方法之一，藥物洗脫支架(DES)的臨床應用促使PCI術(shù)后ISR和再次靶血管血運重建率顯著降低，但是由于越來越多復雜冠狀動脈病變患者和高危CHD患者接受介入治療，ISR發(fā)生率仍高達5%～20%〔8〕。再狹窄的發(fā)生涉及多種病理生理學機制，包括持續(xù)存在的VSMCs的過度增殖與遷移、血管內(nèi)皮細胞損傷、相關(guān)炎癥反應及血管新生內(nèi)膜過度增生。有學者研究顯示，組織因子暴露為支架置入后刺激血栓形成的重要因素，大約在1 w血小板聚集并形成血栓達到最高值。血栓形成加重發(fā)生再狹窄，血小板活化過程中釋放的PDGF等刺激中層VSMCs增殖和遷移，導致出現(xiàn)一系列自身修復反應，加重ISR〔9〕。PDGF在VSMCs增殖及遷移、表型轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮重要作用〔10〕。近年來，嘗試研究的一些抑制PDGF及其受體相互作用或抑制其表達，導致抑制VSMCs增殖及遷移的試驗，具有較好的應用前景，只是多數(shù)研究僅局限于細胞水平，并未在整體動物模型上獲得有效驗證；且ASTⅣ對動脈損傷后VSMCs增殖及其遷移的影響及相關(guān)機制較少報道。

目前國際上建立血管再狹窄的動物模型主要有兩種方法：(1)手術(shù)損傷；(2)手術(shù)損傷+高脂飲食。因為實施單純的手術(shù)損傷方法簡便易行，而且不可控因素容易控制，因此國際上目前大多采用單純手術(shù)損傷的方法建立血管再狹窄的整體動物模型。既往研究顯示大鼠血管內(nèi)皮損傷后發(fā)生ISR的機制跟人類支架植入術(shù)后支架內(nèi)再狹窄發(fā)生機制相似，球囊損傷24 h VSMCs即能出現(xiàn)增殖和遷移，14 d VSMCs增殖達最高峰，形成可靠的內(nèi)膜增生。本實驗表明我們成功建立了頸動脈內(nèi)膜損傷模型。作為黃芪主要活性成分的ASTⅣ,具有調(diào)節(jié)機體免疫力、降壓、強心、保護心肌細胞、降低血糖、抗細胞凋亡和抗炎、抗病毒等多方面的藥理作用〔11〕。本研究結(jié)果表明，ASTⅣ顯著降低球囊損傷頸動脈內(nèi)膜面積和內(nèi)膜/中膜比值，且顯示劑量依賴性，從形態(tài)學角度觀察了ASTⅣ在體內(nèi)能夠抑制頸動脈內(nèi)膜增生。PCNA合成及表達在增殖細胞核可增加，但很少出現(xiàn)在靜止細胞，其表達高低表示細胞進行DNA復制和分裂增殖的程度，在細胞周期的S期達最大值，能夠特異性反映S期活性。因此，其表達量測定能夠很好評價VSMCs的增殖狀態(tài)〔12〕。本研究中，模型組大鼠頸動脈球囊損傷后14 d新生內(nèi)膜中PCNA含量最高，其分布顯示“內(nèi)疏外密”的特點，管腔側(cè)較稀疏，近彈力板側(cè)稠密，表明VSMCs由外膜向內(nèi)膜增殖和遷移，這跟其他研究〔13〕報道的平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移的結(jié)論一致。在不同劑量ASTⅣ干預組，新生內(nèi)膜中PCNA表達下降，表明ASTⅣ抑制了平滑肌細胞的增殖和遷移，進一步抑制了頸動脈內(nèi)膜的增生。

既往研究〔14〕表明，PDGF主要來源于巨噬細胞、VSMCs、內(nèi)皮細胞、血小板的α顆粒等。PDGF-BB主要在 VSMCs、 內(nèi)皮細胞、 巨噬細胞和神經(jīng)細胞中表達，是間充質(zhì)細胞(如 VSMCs、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、成纖維細胞等)的強效有絲分裂原，參與調(diào)控細胞增殖、遷移、分化、細胞存活、細胞外基質(zhì)(ECM) 生成等過程。在可溶性多肽、活性氧、低氧等外界刺激下，PDGF以旁分泌、自分泌的方式與細胞膜受體結(jié)合發(fā)揮作用。PDGF可促進多種細胞的增殖，如VSMCs、成纖維細胞、系膜細胞等，與動脈粥樣硬化、支架內(nèi)再狹窄、血管重塑、組織器官纖維化等病理過程密切相關(guān)。本實驗結(jié)果表明PDGF促進了球囊損傷的頸動脈內(nèi)膜增生，與文獻報道結(jié)果一致〔15,16〕。Xu等〔15〕研究指出，大鼠動脈球囊損傷后，血清PDGF-BB水平亦顯著升高；Kim等〔16〕用25 ng/ml PDGF-BB刺激SD大鼠主動脈VSMCs 24 h，采用CCK-8方法分析細胞增殖情況，結(jié)果表明PDGF-BB顯著刺激VSMCs增殖，PDGF-BB組VSMCs的增殖細胞數(shù)達對照組的1.9倍。應用不同劑量的ASTⅣ干預后，頸動脈內(nèi)膜面積、內(nèi)膜/中膜比、PDGF表達顯著降低，證明ASTⅣ抑制了PDGF-BB在新生內(nèi)膜的表達，且ASTⅣ對該生長因子的抑制與PCNA表達抑制的趨勢相一致，但其具體機制尚不清楚，目前認為其可能與ASTⅣ抗氧化反應，清除氧自由基的功能有關(guān)。既往研究表明，球囊損傷后發(fā)生再狹窄與機體的氧化應激反應密切相關(guān)。經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)術(shù)后短時間內(nèi)內(nèi)皮細胞受損部位釋放大量ROS，引起一系列連鎖反應，導致內(nèi)皮功能障礙，釋放眾多細胞因子，進而刺激VSMCs的增殖和ECM重塑〔17〕。ROS通過增加VSMCs中多種生長因子的表達，刺激產(chǎn)生PDGF〔18〕。本研究表明ROS升高導致PDGF-BB表達升高，刺激內(nèi)膜增生，本研究結(jié)果與之一致。不同劑量的ASTⅣ干預后ROS含量呈劑量依賴性的降低，與Leite等〔19〕研究結(jié)果一致。Leite等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮損傷后14 d內(nèi)，促進過氧化硝基物質(zhì)大量生成，導致氧化應激，VSMCs在血管中膜大量增殖。而期間若給予抑制ROS的物質(zhì)，管腔狹窄率顯著降低，同時產(chǎn)生ECM減少，并增加產(chǎn)生一氧化氮。ROS可做為第二信使直接參與到VSMCs增殖的信號通路中。ten Freyhaus等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，加進氧化酶抑制劑能夠抑制PDGF誘導的VSMCs增殖、遷移，進一步證實VSMCs的增殖離不開ROS參與。Qiu等〔21〕研究表明，ASTⅣ能夠抑制ROS產(chǎn)生和升高SOD活性，改善同型半胱氨酸導致的內(nèi)皮失功能。ASTⅣ通過抑制ROS產(chǎn)生，抑制PDGF-BB表達，從而降低了PDGF-BB誘導的VSMCs的遷移和增殖，抑制球囊損傷頸動脈內(nèi)膜的增生，保護血管內(nèi)皮細胞，發(fā)揮預防血管再狹窄的作用。

目前有較多關(guān)于植物提取物對PDGF介導VSMCs增殖及遷移抑制作用的研究，但多是從細胞實驗加以驗證，相應的ISR動物實驗較少。曾有報道ASTⅣ能夠保護血管內(nèi)皮細胞〔22〕，本研究通過應用不同劑量的ASTⅣ干預球囊損傷大鼠頸動脈模型，在整體動物水平證實ASTⅣ抑制了球囊損傷的頸動脈內(nèi)膜增生，并以PDGF為靶點，球囊損傷頸動脈內(nèi)膜后刺激ROS表達升高，ROS介導PDGF表達升高，而ASTⅣ呈劑量依賴性的抑制動脈內(nèi)膜ROS介導的PDGF升高，進而防止內(nèi)膜過度增生，為ISR的治療提供了新靶點，但其詳細的機制仍需進一步深入研究。