苦蕎轉錄因子基因FtMYC的克隆及其表達與花青素積累的相關性分析

姚攀鋒，呂兵兵，李 琪，董玘鑫，王安虎，吳 琦*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，四川 雅安625014；2.西昌學院，四川 西昌615000）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）屬于蓼科蕎麥屬一年生草本植物，由于其富含蘆丁、花青素等黃酮類化合物，因此，對人體具有降“三高”等多種保健功能[1]。與此同時，黃酮類化合物也有助于提高植物對逆境的耐受力，植物會通過調(diào)控黃酮化合物合成相關基因的表達對環(huán)境刺激迫作出響應，由此形成一種自我保護機制[2]。研究表明，苦蕎黃酮中的花青素含量上升常常伴隨著逆境的出現(xiàn)，參與抵抗紫外輻射、抗寒和抗旱等多個生理過程。Li S.等[3]對芽期苦蕎子葉和胚軸分別進行了低溫脅迫后發(fā)現(xiàn)，處理后苦蕎子葉和胚軸中花青素含量均顯著提高。此外，苦蕎冷處理后的轉錄組和代謝組分析顯示，4℃脅迫之后苦蕎的矢車菊素3-0-葡萄糖苷和矢車菊素3-0-蕓香糖苷相比正常條件下分別提高了6.3和11.3倍[4]。因此，花青素作為苦蕎體內(nèi)一類重要的黃酮類化合物，在苦蕎的抗逆機制中起著重要的作用。

花青素生物合成途徑是類黃酮物質(zhì)合成途徑的一個分支，參與其生物合成相關的基因主要包括結構基因和轉錄因子這兩大類，二者共同調(diào)控植物花青素的代謝合成[5]。參與花青素支路調(diào)控的轉錄因子眾多，主要包括MYB、bHLH和WD40等，它們單獨或者形成復合物發(fā)揮生物學作用[5]。其中，bHLH轉錄因子是植物中僅次于MYB轉錄因子的第二大轉錄因子超家族廣泛存在于植物中，在植物的生長發(fā)育與形態(tài)建成、次級代謝產(chǎn)物的合成及對外界環(huán)境脅迫應答中起著重要的調(diào)控作用[5-6]。例如，在番茄中持續(xù)表達ZmLc、Delila和MYC-RP/GP等bHLH類蛋白，能使花青素在地上部分(包括果實)和根中大量積累[7]。過表達Delila（bHLH）基因，在果實中特異的啟動子E8的控制下，能導致花青素在果肉和果皮中強烈的增加，果實呈暗紫色[5]。可見，bHLH轉基因能激活花青素代謝途徑中一系列結構基因，促進花青素等黃酮物質(zhì)在植物中的大量積累，較單個結構基因的轉基因具有更為廣泛的作用。

本實驗根據(jù)獲得的苦蕎花期轉錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR技術克隆出一條與花青素調(diào)控相關的bHLH轉錄因子MYC亞家族的基因FtMYC，并采用UV-B、4℃冷脅迫處理二葉期苦蕎，探究FtMYC基因在非生物脅迫條件下的表達量變化與花青素含量的相關性，并分析了FtMYC基因啟動子上的主要順式作用元件，初步明晰FtMYC的結構及其在苦蕎逆境脅迫中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料及主要試劑

苦蕎“西蕎2號”由西昌學院王安虎教授惠贈，栽培在四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院人工氣候室；植物RNAout（Trizol法）試劑盒、TaqDNA聚合酶、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、SYBR Premix ExTaqTMII（Perfect Real Time）購自TaKaRa公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦蕎FtMYC基因的克隆

采用SDS法提取苦蕎葉片總DNA，采用植物RNAout試劑盒參照說明書提取苦蕎總RNA，并反轉錄制備cDNA第一條鏈。根據(jù)本實驗室的苦蕎花期轉錄組數(shù)據(jù)，設計一對特異引物分別以苦蕎總DNA和cDNA第一鏈為模板擴增FtMYCDNA和cDNA序列，引物序列：FtMYCf（5'-ATGCAGGCAAATCTC AGAGAAC-3'）和FtMYCr（5'-TCACCCACATTTCG TTATAGCT-3'）。將PCR產(chǎn)物亞克隆至T載體，送擎科生物技術有限公司測序。

1.2.2 苦蕎FtMYC基因的生物信息學分析

通過NCBI在線工具Blast對FtMYC氨基酸序列進行同源比對；通過DNAMAN軟件FtMYC及其它同源蛋白進行多重序列比對，分析它的保守結構域；通過MEGA 5.0軟件，根據(jù)鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建FtMYC的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.3 二葉期苦蕎的脅迫處理

UV-B處理：使用10W UV-B（308 nm）LED燈照射二葉期苦蕎，光照距離30 cm；4℃冷處理：在光照條件為16 h/8 h(光照/黑暗)、4℃的培養(yǎng)箱對子葉期的苦蕎進行冷處理。以上處理均在處理前0 h、處理后1、3、6、12、24和48 h分別取樣品的胚軸和子葉液氮速凍后放在-80℃超低溫冰箱保存。

1.2.4 苦蕎FtMYC基因表達量的檢測

根據(jù)FtMYC基因序列，設計一對熒光定量PCR引物：qFtMYCf（5'-AAT GCG AAT CAG GCG GAC A-3'）和qFtMYCr（5'-GGC ACC CAA CTC GACA ACA C-3'）。以苦蕎FtH3基因為內(nèi)參基因，其引物為：qFtH3f（5'-GAA ATT CGC AAG TAC CAG AAG AG-3'）和qFtH3r（5'-CCA ACA AGG TAT GCC TCA GC-3'）。以cDNA為模板，采用SYBR Premix ExTaqTMII（Perfect Real Time）試劑盒檢測FtMYC基因在不同條件處理下的表達水平，通過2-ΔΔCt方法來計算它的相對表達量。

1.2.5 苦蕎花青素的提取及定量測定

準確稱取0.2 g新鮮樣品用液氮研磨后加入1 mL 1%鹽酸的甲醇提取液在25℃、100 r/min條件下震蕩浸提18 h；3 080 r/min離心15 min后取500μL上清，并加入等體積的雙蒸水和300μL氯仿混勻；2 268 r/min離心5 min后取上清，即為花青素提取液。最后通過紫外分光光度計檢測530 nm和657 nm處的吸光值。采用如下公式計算花青素的量：花青素（mg/g）=（A530-0.25×A657）/鮮質(zhì)量。

1.2.6 苦蕎FtMYC基因啟動子克隆及的生物信息學分析

根據(jù)苦蕎基因組數(shù)據(jù)（http：//gsa.big.ac.cn/index.jsp），設計一對特異引物PFtMYCf（5'-CGG GAA TAT AAT GAT TCG AGA CAA-3'）和PFtMYCr（5'-CAT TAT GCT TTG ACA AGC AAG C-3'），以苦蕎DNA為模板擴增FtMYC基因啟動子序列，PCR產(chǎn)物亞克隆至T載體后，送擎科生物技術有限公司測序。通過Plant CARE數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）數(shù)據(jù)庫對基因5’側翼序列所含元件進行分析預測，利用啟動子核心分析數(shù)據(jù)庫BDGP（http：//www.fruitfly.org/seq-tools/promoter.html）對FtMYC基因啟動子的核心元件進行預測。

1.3 數(shù)據(jù)的分析和處理

采用IBM SPASS Statistics 20.0統(tǒng)計軟件對苦蕎FtMYC基因的表達量與各樣本花青素的量進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 FtMYC基因cDNA序列的克隆

分別以苦蕎cDNA和總DNA為模版擴增得到2條大小約為1 300 bp的特異條帶，見圖1。測序結果顯示該基因的cDNA和DNA片段分別為1 287和1 309 bp。根據(jù)已獲得的苦蕎FtMYC基因的cDNA和DNA序列，利用DNAMAN軟件比對確定其全長DNA序列為1 309 bp，有1個外顯子和1個內(nèi)含子構成（見圖2），符合標準的GT-AG剪切原則。Blastp比對結果表明，苦蕎FtMYC基因屬于bHLH-MYC亞家族。選取bHLH家族中擬南芥AtGL3、葡萄VvMYCA1、紫蘇PfMYC-RP和金魚草AmDELILA進行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)苦蕎FtMYC在N-端包含一個由191個氨基酸組成的bHLH-MYC-N結構域，該結構域屬于bHLH轉錄因子家族中MYC蛋白的特殊結構域[8]，見圖3。在C-端的bHLH結構域處也具有較高的保守性。以上結果表明，本文獲得的FtMYC基因屬于bHLH轉錄因子中的MYC亞家族，其在GenBank中的登錄號為：KU162971。

圖1 苦蕎FtMYC基因cDNA和啟動子的擴增Figure 1 Amplification of FtMYC and promoter from tartary buckwheat

圖2 苦蕎FtMYC基因結構示意圖Figure 2 Structure diagram of FtMYC

圖3 不同植物bHLH氨基酸序列比對Figure 3 Alignment of amino acid sequences of bHLH from different plants

2.2 苦蕎FtMYC系統(tǒng)進化分析

采用MEGA 5.0鄰接法構建基于FtMYC氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（見圖4）。選擇均已有功能相關性研究的植物MYC蛋白序列，結合M.Heim等[9]根據(jù)bHLH保守域氨基酸組成特點對擬南芥133個bHLH蛋白的結構解析及分類，初步分析苦蕎該FtMYC可能具有的功能。圖4中的進化樹分析表明，這些MYC蛋白可明顯分為4個大簇，由于這4簇之間氨基酸序列間差異較大，推測其具有不同的進化模式，表現(xiàn)出功能分化?？嗍w（Fagopyrum tataricum）FtMYC與擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtGL3、葡萄（Vitis vinifera）VvMYCA1、紫蘇（Perilla frutescens）PfMYC-RP和金魚草（Antirrhinum majus）AmDELILA歸于一簇，而這些蛋白均參與花青素代謝的有關調(diào)控，推測苦蕎FtMYC具有相似的功能。

2.3 非生物逆境脅迫下苦蕎FtMYC的表達與花青素含量分析

2.3.1 UV-B對苦蕎FtMYC表達和花青素含量的影響

使用熒光定量PCR分析FtMYC在UV-B處理下芽期苦蕎的轉錄水平，結果表明：在胚軸中，F(xiàn)tMYC的表達量從處理1 h開始上升，每隔3 h呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，處理2 h后顯著上升（P＜0.05），為處理前（0 h）的1.83倍（見圖5）；子葉中，F(xiàn)tMYC在的表達量變化則更為明顯，處理6 h后極顯著上升（P＜0.01），為對照組的13.29倍，隨后下降，48 h后接近處理前水平（見圖6）。同時，花青素含量分析結果表明：胚軸中的花青素含量隨著處理時間不斷升高，12 h后為對照組的1.88倍并趨于穩(wěn)定（見圖5）；子葉中花青素含量的變化更為明顯，處理6 h后顯著性提高（P＜0.05），對照組的1.44倍（見圖6）。

圖4 苦蕎FtMYC與其他植物來源MYC蛋白序列的系統(tǒng)進化樹Figure 4 Phylogenetic tree based on amino acids equences of FtMYC and other plants

圖5 UV-B對苦蕎胚軸FtMYC表達量和花青素含量的影響Figure 5 Expression levels FtMYC gene and anthocyanins content in hypocotyl under UV-B treatment condition

2.3.2 冷脅迫對苦蕎FtMYC表達和花青素含量的影響

使用熒光定量PCR分析FtMYC在冷處理下芽期苦蕎的轉錄水平，結果表明：FtMYC在胚軸中的表達量從處理1 h開始上升，但上升趨勢不明顯，12 h后達到最大為對照組的1.67倍，之后下降接近對照水平（見圖7）；而FtMYC在子葉中的表達量變化卻很明顯，1 h后就發(fā)生極顯著性變化（P＜0.01），12 h后達到對照組的15.3倍，之后降低為對照組的1.83倍（見圖8）。花青素含量測定結果顯示：在該條件下苦蕎胚軸、子葉中花青素含量的變化趨勢基本一致，均在12 h后極顯著提高（P＜0.01），分別為對照組的2.29倍和1.94倍。

圖6 UV-B對苦蕎子葉FtMYC表達量和花青素含量的影響Figure 6 Expression levels FtMYC gene and anthocyanins content in cotyledon under UV-B treatment condition

2.3.3 苦蕎FtMYC基因表達與花青素含量的相關性分析

使用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件分析不同脅迫條件下苦蕎胚軸和子葉中FtMYC基因的相對表達量與花青素含量的相關性（見表1）。以相關系數(shù)（r）絕對值大于0.75位閾值時，UV-B處理下FtMYC表達量與苦蕎胚軸中花青素含量變化顯著性相關（r=0.798，P＜0.05），與子葉中花青素含量變化極顯著相關（r=0.887，P＜0.01）。4℃冷處理下FtMYC表達量與苦蕎胚軸中花青素含量變化沒有明顯的相關性（r=0.744），但與子葉中花青素含量變化顯著性相關（r=0.814，P＜0.05）。結果表明，苦蕎FtMYC基因表達量與花青素含量具有較強的正相關。

圖7 冷脅迫對苦蕎胚軸FtMYC表達量和花青素含量的影響Figure 7 Expression levels FtMYC gene and anthocyanins content in hypocotyl under cold treatment condition

圖8 冷脅迫對苦蕎子葉FtMYC表達量和花青素含量的影響Figure 8 Expression levels FtMYC gene and anthocyanins content in cotyledon under cold treatment condition

表1 苦蕎子葉和胚軸中花青素含量與FtMYC基因表達量的相關性Table 1 Correlation coefficients between FtMYC expression levels and total anthocyanins contents in cotyledons and hypocotyl of Tartary buckwheat

2.4 FtMYC基因啟動子元件分析

以苦蕎DNA為模版，PCR擴增得到一條1684bp的特異條帶，見圖1。測序結果與苦蕎基因組數(shù)據(jù)完全一致，表明獲得了FtMYC基因的啟動子序列，將其命名為pFtMYC。本研究進一步采用DNAMAN軟件對pFtMYC的序列進行了生物信息學分析，結果顯示：pFtMYC序列包含了63.7%的A/T堿基，符合植物啟動子的基本特征。通過在線網(wǎng)站對該啟動子序列的分析結果顯示，pFtMYC中包含有大量的順式作用元件，比如啟動子核心元件、環(huán)境和激素類響應元件等（見表2）。其中，與環(huán)境響應相關的元件所占比例較大，例如低溫應答元件、光響應元件、真菌誘導調(diào)節(jié)元件、熱脅迫響應元件等等。此外，pFtMYC中還存在一些其他類型的元件，如激素應答元件、蛋白結合位點以及分生組織表達相關應答元件。以上表明，多種環(huán)境因子均可調(diào)控苦蕎FtMYC基因的表達。

3 討論與結論

MYC蛋白屬于bHLH家族的轉錄因子，該類轉錄因子在動植物體內(nèi)具有多種生物學功能。MYC蛋白的N-端含有一個bHLH-MYC-N結構域，C-端含有一個結合目的基因啟動子中E-box的bHLH型DNA結合域，MYC蛋白主要通過結合靶標基因啟動子序列中E-box元件的保守序列CAC(G/A)TG來調(diào)節(jié)基因的表達[8]。本研究利用苦蕎轉錄組數(shù)據(jù)成功克隆得到1個bHLH家族的轉錄因子基因FtMYC，因其編碼的氨基酸序列N-端和C-端區(qū)域分別包含有MYC轉錄因子典型的保守結構域，這表明FtMYC屬于bHLH轉錄因子中MYC家族的一個成員。

植物bHLH轉錄因子能夠參與調(diào)控多種生理途徑，如花器官發(fā)育、光形態(tài)建成、植物抗逆等，其中調(diào)節(jié)類黃酮和花青素合成是植物bHLH轉錄因子最重要功能之一[10]。系統(tǒng)進化樹分析顯示（見圖4），F(xiàn)tMYC和VvMYCA1等參與花青素調(diào)控的轉錄因子共聚一簇，推測FtMYC可能具有類似的調(diào)控功能。在UV-B和4℃冷脅迫處理條件下，F(xiàn)tMYC在苦蕎二葉期胚軸和子葉中的表達量均表現(xiàn)出一定程度上調(diào)趨勢，相比之下在子葉中變化趨勢更為顯著，這種結果表明FtMYC在苦蕎二葉期更傾向于在子葉中發(fā)揮調(diào)控作用。與此同時，當FtMYC在兩個組織中的表達量達到最大值后在都出現(xiàn)了不同程度下降的趨勢，可能是因為植物本身存在自我修復機制，在遭到外界脅迫一定時間后通過該機制來維持機體的代謝平衡[11]。眾所周知，花青素對UV-B波段存在特定吸收波長，能有效降低UV-B輻射在表皮層的透過率，從而減輕UV-B對植物器官與組織的傷害[12]。而當植物處于極端溫度逆境下，主要通過影響細胞的膜結構從而產(chǎn)生氧化脅迫[13]，由于花青素本身具有較強的抗氧化作用，因此花青素在植物組織中的積累可以增強其對于極端環(huán)境的耐受性[14]。例如，蘋果MdbHLH3轉錄因子能在低溫條件下會特異性結合MdDFR和MdUFGT基因啟動子序列，通過上調(diào)花青素支路的關鍵基因的表達促進蘋果中花青素的積累[15]。本研究中除了4℃冷處理下FtMYC表達量與苦蕎胚軸中花青素含量變化沒有明顯的相關性（r=0.744）外，其他條件下均顯著性相關。由此可知，F(xiàn)tMYC也可能通過類似的調(diào)控機制實現(xiàn)了苦蕎體內(nèi)花青素的積累，以此來應對外界的非生物逆境脅迫。

表2 pFtMYC所含主要元件分析Table 2 Component analysis of pFtMYC

轉錄水平的調(diào)控是植物基因表達調(diào)控的一種重要方式，而啟動子作為執(zhí)行轉錄水平調(diào)控的主要順式作用元件，能應答多種環(huán)境的變化[16]。轉錄因子對環(huán)境刺激的響應主要是通過其啟動子上各類響應元件實現(xiàn)的[17]，Yao P.F.等[18]對pFtbHLH3研究結果顯示，干旱脅迫處理會提高pFtbHLH3下游報告基因的表達量。本研究在對FtMYC啟動子的分析中發(fā)現(xiàn)，pFtMYC中除了含有基本的啟動子轉錄元件外，還包含有多個與光、低溫脅迫應答相關的元件，我們推測FtMYC的表達可能通過這些元件響應外界環(huán)境的刺激。本課題組后續(xù)也將對FtMYC的功能展開進一步研究，以期明晰FtMYC轉錄因子在苦蕎花青素合成的調(diào)控機制，為提高苦蕎黃酮含量的研究奠定一定的理論基礎。