急性熱應激對西伯利亞鱘肝功指標及肝臟熱休克蛋白表達的影響

王曉雯，張 蓉，朱建亞，劉麗麗，馬國慶，朱 華

（北京市水產(chǎn)科學研究所/漁業(yè)生物技術北京市重點實驗室，北京100068）

鱘魚屬于硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鱘形目，是我國重要的淡水經(jīng)濟魚類，在20多個省市均有養(yǎng)殖[1]。西伯利亞鱘（Acipenser baeri）是最重要的鱘魚養(yǎng)殖品種之一，為亞冷水性魚類，適宜的生長溫度為16.7～24.7℃[2]。魚類作為變溫動物，水體溫度是其生長發(fā)育最重要的環(huán)境因子之一，不但可直接影響魚類的攝食、生長、免疫和生殖等活動，而且水溫改變可間接對魚類產(chǎn)生影響。超出魚類生理適應范圍的溫度都會引起魚類的應激反應，導致其生理失衡和免疫力下降[3-5]。近年來，全球氣候變暖對水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來的影響逐漸引起人們的關注。隨著鱘魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖水體負載越來越大，夏季長時間的高溫超過魚類的適應范圍，引起魚類的應激反應、甚至病害頻發(fā)，給鱘魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失[6-7]。

魚類通過內(nèi)分泌和生理功能的改變來應對環(huán)境的變化，有學者研究表明高溫對魚類的生長[7-9]、抗氧化酶活[8-11]、消化酶活[11-12]、代謝和非特異性免疫指標[13-14]等方面均有不同程度影響前期，王靜波等[6]和田照輝等[15]學者們對鱘魚響應熱應激的研究集中于血清抗氧化指標、非特異性免疫指標和鰓組織熱休克蛋白70基因（hsp70）的表達變化。然而肝臟作為魚類消化系統(tǒng)的一部分，是魚類最主要的消化腺，在魚類的物質代謝、解毒和防御生命活動中扮演著極為重要的角色，高溫應激下鱘魚的肝臟是否能應對脅迫免受損傷值得研究。血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）是動物體內(nèi)的兩種重要氨基轉移酶，在平衡機體氨基酸以及蛋白質、脂質與糖類間物質轉化中發(fā)揮重要作用[16]。健康狀況下，ALT和AST主要存在于肝臟中，只有少量被釋放到血液中，因此是檢測肝臟功能是否正常的重要指標[12]。血液中蛋白含量高低是衡量魚體的生理狀態(tài)的指標之一，相對穩(wěn)定的蛋白濃度表明魚體生理狀態(tài)平穩(wěn)[17]，血清蛋白質主要也是在肝臟合成并釋放到血液中，故血清蛋白含量也可反應機體肝臟的健康程度。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類在生物進化中最保守的應激蛋白，很多學者發(fā)現(xiàn)其在環(huán)境脅迫因子（高溫、重金屬和微生物感染等）刺激下表達量顯著升高[18-21]，D.Parsell、D.A.Picard等[22-23]的研究表明HSP70和HSP90均可通過降解異常蛋白促進蛋白的正確重折疊而在應對熱脅迫時發(fā)揮重要調節(jié)作用。

本研究將從西伯利亞鱘血清的肝功指標和肝臟hsp70和hsp90β的表達變化這兩方面重點探究西伯利亞鱘的肝臟對熱應激的響應。本研究結果擬為鱘魚抗高溫應激調控提供基礎數(shù)據(jù)，將有助于鱘魚生產(chǎn)者理解熱應激的生理變化、評估熱應激的不利影響并做好熱應激預防。

1 材料和方法

1.1 試驗魚及飼養(yǎng)

西伯利亞鱘幼魚來自北京市十渡鱘魚繁殖基地，體重為（34.905±3.761）g，挑選規(guī)格統(tǒng)一的健康西伯利亞鱘進行試驗。試驗前在循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d，水溫（23±1）℃。養(yǎng)殖容器為圓柱形PP水槽，內(nèi)徑約1 m，水深0.5 m；試驗用水為曝氣后的自來水。試驗期控制水溫（23±1）℃，日投餌量為魚體質量的1%，每天分3次投喂；定期排污。取樣前24 h內(nèi)停止投喂。

1.2 半致死高溫的確定

將120尾23℃暫養(yǎng)的試驗魚隨機轉入30℃、31℃和32℃和33℃的水體（60 cm×40 cm×40 cm），每個溫度組設置3個平行，每個平行10尾魚。充入足夠的空氣，觀察96 h內(nèi)鱘魚的死亡情況，及時撈出死魚，計算累計死亡率。

1.3 高溫脅迫試驗

根據(jù)半致死高溫試驗結果，選擇30℃作為急性熱應激的水溫。23℃暫養(yǎng)7 d后，采集6尾魚作為0 h樣品，其余60尾西伯利亞鱘迅速轉入30℃的水體，并設置3個水槽，作為平行組，進行熱應激試驗。分別在熱應激后3、6、12、24、48和96 h，每組隨機選取6尾鱘魚，MS-222麻醉后尾靜脈取血，采集肝臟樣品，液氮速凍后轉至-80℃保存，用于提取RNA。采集的血液室溫放置2 h，4℃靜置16 h，3 000 r/min離心10 min，取上清，制得血清，用于測定血清的肝功指標。

1.4 血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶活力和總蛋白濃度的測定

谷丙轉氨酶活力（ALT）、谷草轉氨酶活力（AST）測定采用微量酶標法。

谷丙轉氨酶活力以卡門氏單位表示，定義為1 mL液體，反應液總容量3 mL，波長340 nm，1 cm光徑，25℃，1 min內(nèi)與底物L-丙氨酸和α-酮戊二酸所生成的丙酮酸，使還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化成氧化態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸而引起吸光度每下降0.001為一個單位（1卡門氏單位=0.482 IU/L，25℃）。

谷草轉氨酶活力以卡門氏單位表示，定義為1 mL液體，反應液總容量3 mL，波長340 nm，1 cm光徑，25℃，1 min內(nèi)與底物L-天門冬氨酸和α-酮戊二酸所生成的草酰乙酸，使還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化成氧化態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸而引起吸光度每下降0.001為一個單位（1卡門氏單位=0.482 IU/L，25℃）

血清總蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍法，使用考馬斯亮藍測定試劑盒測定。

白蛋白濃度采用溴甲酚綠比色法。有非離子型表面活性劑存在時，溴甲酚綠可與白蛋白形成藍綠色復合物，顏色的深度與樣本中白蛋白濃度成正比。以上測定均使用測試試劑盒（南京建成生物工程研究所），在Econ全波長酶標儀（BioTek）上進行測定。

1.5 西伯利亞鱘肝臟組織RNA的提取和cDNA的合成

取大約3 mg肝臟組織加入800μL TRIzol（Takara），按照該試劑附的操作方法采用氯仿抽提法提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

以提取的總RNA（濃度為300 ng/μL）為模板，采用TransScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒（Takara），以Oligo（dT）為反轉錄引物，按試劑盒操作手冊合成cDNA。根據(jù)NCBI上已有的hsp70（HM348777.1）和hsp90β（JX477807.1）cDNA序列，使用Primer 5.0軟件設計實時熒光定量引物，分別為hsp70-F，hsp70-R，hsp90β-F，hsp90β-R，引物序列見表1，并由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。

標準曲線的制作:對部分樣品cDNA進行混合，進行4倍梯度稀釋，以稀釋后的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，每個模板設3個重復。熒光定量PCR反應體系（20μL）:SYBR Premix ExTaq10μL，上下游引物各0.4μL，模板1μL，ddH2O 8μL，ROX II 0.2μL。反應條件為:95℃預變性5 min，95℃15 s，59.6℃30 s，40個循環(huán)。實時連續(xù)測定擴增過程中的熒光值，建立標準曲線。

以西伯利亞鱘18S rDNA（引物設計為18S-F，18S-R）作為內(nèi)參，使用ABI7500熒光定量PCR儀，對熱應激后所有肝臟cDNA樣品進行分析，反應體系及反應條件與標準曲線的建立一致，每個樣品設3個重復。設定0 h樣品該基因的表達量為“1”，結果采用2-ΔΔCt法計算。

表1 試驗中用到的引物序列Table 1 Primers used in the experiment

圖1 不同溫度應激下西伯利亞鱘幼魚的累計死亡率Figure 1 The accumulative total mortality of Acipenser baeriunder different water temperature

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示。利用SPSS17.0軟件的ANOVA單因素方差分析，對不同組織間均值進行統(tǒng)計學顯著性差異分析。首先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，如果ANOVA分析有意，再用Duncan進行兩兩比較。顯著性水平設為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 西伯利亞鱘幼魚的半致死高溫

96 h內(nèi)不同高溫應激下西伯利亞鱘的死亡情況，見圖1。試驗結果表明，西伯利亞鱘幼魚（34.905±3.761）g的半致死高溫為31℃。30℃應激下，鱘魚沒有發(fā)生死亡，考慮到急性熱應激試驗選擇一個溫度高但不發(fā)生死亡的溫度，所以選擇30℃作為本試驗的急性熱應激溫度。

2.2 熱應激對西伯利亞鱘的血清谷丙轉氨酶活力、谷草轉氨酶活力的影響

在熱應激后（見圖2），西伯利亞鱘血清谷丙轉氨酶活力逐步升高，48 h時達到峰值，顯著高于0時刻（P＜0.05）。然而在96 h時，其谷丙轉氨酶活力迅速降低至0時刻水平。

圖2 熱應激對西伯利亞鱘血清谷丙轉氨酶活力的影響Figure 2 Effects of heat stress on the activity of serum ALT in Acipenser baeri

在熱應激6 h，西伯利亞鱘血清谷草轉氨酶活力開始緩慢升高，48 h較24h迅速升高，并達到峰值（圖3）。96 h時，西伯利亞鱘谷草轉氨酶活力有所下降，但仍顯著高于0時刻的酶活力（P＜0.05）。

圖3 熱應激對西伯利亞鱘血清谷草轉氨酶活力的影響Figure 3 Effects of heat stress on the activity of serum AST in Acipenser baeri

2.3 熱應激對西伯利亞鱘血清蛋白濃度的影響

如圖4所示，熱應激后3～12 h，西伯利亞鱘幼魚的血清總蛋白濃度緩慢上升，于12 h達到一個較高點，至24和48 h血清總蛋白濃度有所下降，96 h達到0時刻水平?？梢?，血清總蛋白濃度整體維持恒定，魚體生理狀態(tài)平穩(wěn)。

圖4 熱應激對西伯利亞鱘總蛋白濃度的影響Figure 4 Effects of heat stress on the serum total protein concentrations in Acipenser baeri

西伯利亞鱘幼魚血清白蛋白濃度除24 h外，在熱應激后不同時間點，均顯著低于0時刻，但各時間點之間無顯著差異（見圖5）?？梢?，高溫刺激后，西伯利亞鱘幼魚肝臟的功能受到影響，白蛋白合成量有所減少。

圖5 熱應激對西伯利亞鱘白蛋白濃度的影響Figure 5 Effects of heat stress on the serum albumin concentrations in Acipenser baeri

2.1 熱應激下西伯利亞鱘肝臟hsp70和hsp90β的表達情況

應用Applied Biosystems7500熒光定量PCR儀自帶軟件程序設置生成標準曲線。以CT值作為縱坐標，基因相對拷貝數(shù)的對數(shù)作為為橫坐標制作標準曲線，結果如表2所示。3個標準曲線的R2值均大于0.99，具有良好的線性關系，擴增效率E值均位于96.25%～110%之間，說明這3對熒光定量引物可用于后續(xù)試驗。

表2 3對引物的擴增效率及擬合度Table 2 Amplification efficiency and degree of fitting of three pairs of primers

熱應激下西伯利亞鱘肝臟hsp70和hsp90βmRNA的相對表達量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（圖6，7），二者表達量在6 h達到峰值（P＜0.05），hsp70mRNA的轉錄水平達到0時刻的15.61倍，hsp90βmRNA的轉錄水平達到0時刻的15.55倍。西伯利亞鱘肝臟hsp90β對熱應激的反應更敏感，3 h時其相對表達量即升高到0時刻的7.43倍，高于hsp70mRNA的相對表達量（4.66倍）。48 h，hsp70mRNA和hsp90βmRNA的轉錄水平均迅速降低，于熱應激96 h時恢復到0時刻水平。

圖6 熱應激對西伯利亞鱘肝臟hsp70 mRNA相對表達量的影響Figure 6 Effects of heat stress on the expression levels of hsp70 mRNA in Acipenser baeri liver

圖7 熱應激對西伯利亞鱘肝臟hsp90βmRNA相對表達量的影響Figure 7 Effects of heat stress on the expression levels of hsp90βmRNA in Acipenser baeri liver

3 討論與結論

水溫是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的環(huán)境因子之一，與魚類的代謝相關，影響魚類生理生化，當水溫超過魚體耐受極限將導致魚體代謝紊亂，甚至發(fā)生死亡[24]。研究西伯利亞鱘幼魚的致死溫度有利于了解其耐高溫能力，為鱘魚的養(yǎng)殖提供參考數(shù)據(jù)。本研究采用急性應激的方法，得到西伯利亞鱘幼魚從23℃的養(yǎng)殖水溫中直接升到31℃可引起死亡。李文龍等[24]在3種鱘科魚類臨界水體溫試驗中（7.6±0.3）g的小體鱘、史氏鱘和俄羅斯鱘的存活最高溫度分別為32℃、33℃和33℃，較本研究中西伯利亞鱘的致死溫度略高，這是由于李文龍等的研究是采取梯度升溫的方式，魚體已逐漸產(chǎn)生耐受性，所以耐受的溫度比急性升溫的耐受溫度要高。

魚類的血清酶主要來自特定的組織器官，其活性的高低與相應組織器官的代謝水平和健康程度有關，血清酶活的變化反映了組織器官功能的變化。ALT和AST是機體最重要的反映物質轉化的代謝酶，由肝臟分泌表達，在魚體健康狀況下，釋放到血液中的含量較少。因此ALT和AST的酶活變化是反應機體肝臟功能的重要指標。管標等[12]在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）受到熱應激后，血清ALT和AST活性均在恢復時有顯著升高，肝臟受到破壞作用。李佳凱等[25]的研究顯示大黃魚（Larimichthys crocea）幼魚從25℃到32℃維持7 d的高溫脅迫后血清ALT和AST活力極顯著高于對照組。在本研究中，西伯利亞鱘幼魚在急性熱應激下血清ALT和AST酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，均在熱應激后48 h達到峰值，顯著高于0時刻（P＜0.05），表明鱘魚受到熱應激48 h內(nèi)肝臟功能受到影響，并在96 h逐步恢復。血清蛋白主要在肝臟合成，肝功能的損傷程度影響著蛋白的合成，血清總蛋白及白蛋白含量檢測可及時反映肝臟的蛋白合成能力。半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）在受到高溫脅迫后，血清白蛋白持續(xù)下降[26]。高溫和低溫急性脅迫均會使期許氏平鮋（Sebastes schlegelii）血清總蛋白和白蛋白水平著降低[27]。大黃魚在高溫脅迫7 d時，血清總蛋白含量同樣顯著低于對照組[25]。本研究中，急性熱應激后，西伯利亞鱘幼魚的血清總蛋白含量總體維持穩(wěn)定，在脅迫24 h和48 h其含量略有降低，而白蛋白含量在脅迫3～96 h除24 h外均顯著低于0時刻（P＜0.05）。說明高溫脅迫后，西伯利亞鱘幼魚的肝臟損傷不是特別嚴重，血清蛋白能基本維持穩(wěn)態(tài)，這與他人的研究結果不同，可能高溫脅迫對不同魚類血清蛋白的影響各有不同。而白蛋白作為營養(yǎng)物質的載體，為機體提供能量，參與維持血漿滲透壓，急性熱應激后，機體大量消耗白蛋白，以滿足機體較高的能量需求。

熱休克蛋白（HSP）是一類保守的，參與生物體應對多種應激過程的蛋白質，如應對熱應激、清除體內(nèi)氧自由基、誘導細胞凋亡和加強免疫反應[28]。HSP70和HSP90是這個家族中分別為70 kDa和90 kDa大小的蛋白質家族[29]。本研究中，西伯利亞鱘幼魚肝臟的hsp70和hsp90β均在急性熱應激后出現(xiàn)顯著性上調表達，表明肝臟存在一定的損傷，熱休克蛋白可能通過上調表達而發(fā)揮保護細胞的作用。這與Rendell J.L.等[30]研究發(fā)現(xiàn)hsp90在O.mykiss的肝臟組織中有顯著的上調表達，Wu C.X.等[31]在高溫應激下得到草魚（Ctenopharyngodon idella）hsp90表達量上調最顯著的組織是肝臟，以及Wang Y.等[32]在鯉魚（Cyprinus carpio）肝臟中hsp70的顯著上調表達相一致。眾多研究表明HSP70可快速并顯著地上調表達以適應多種環(huán)境應激，被廣泛地作為一個生物標志[33]。本研究也證實了西伯利亞鱘肝臟hsp70出現(xiàn)顯著上調反應以應對熱應激，補充了田照輝等[15]的關于西伯利亞鱘受到急性熱應激并維持僅3 h的研究，得到hsp70在熱脅迫后表達量達到峰值的時間是6 h。HSP90也是真核細胞中一類可與超過400種蛋白結合的伴侶蛋白，在機體受到多種應激條件下，如熱應激或冷應激，均能上調其表達[34]。櫛孔扇貝（Chlamys farreri）受到熱刺激后，hsp90mRNA表達量顯著上調[35]，泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）在高溫應激下，hsp70、hsp90α和hsp90βmRNA表達量均迅速升高[36]。并且，Wu C.X.等對草魚的研究顯示熱應激和冷應激均會顯著上調多種組織HSP90基因的表達量[31]，這些均與本研究結果相一致。

綜上所述，本文對一種軟骨硬鱗魚類-西伯利亞鱘幼魚肝臟組織在受到急性熱應激下的血清肝功指標及肝臟熱休克蛋白70和90的轉錄表達進行分析。結果提示我們:西伯利亞鱘幼魚的肝臟功能在急性熱應激下受到一定影響，但是在應激96 h后均恢復到正常水平；肝臟中hsp70和hsp90β均上調表達，參與生理調節(jié)，以應對高溫對肝臟細胞的損傷。