卷煙煙氣小動物口鼻暴露方法的建立及評價

高茜，劉欣，管瑩，曾婉俐，向海英，米其利，楊光宇，李雪梅

云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心 云南省昆明市紅錦路367號

卷煙煙氣是一種含有顆粒物、揮發(fā)性有機(jī)物和氣體的混合物。在利用動物模型研究其生物學(xué)效應(yīng)的暴露方法中，口鼻暴露系統(tǒng)和全身暴露系統(tǒng)是煙氣生物學(xué)效應(yīng)研究的兩種主要方式，其中口鼻暴露方式與全身暴露相比，避免了動物毛發(fā)對暴露氣溶膠的吸附和過濾[1]，同時還可以迅速使暴露塔內(nèi)的氣溶膠分布均勻并節(jié)省樣品等優(yōu)點，是各類化學(xué)物質(zhì)及混合物嚙齒類動物急性、亞急性和亞慢性吸入暴露的主要方式[2]。國際經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）測試導(dǎo)則（TG）健康效應(yīng)部分TG 403、436、412、413等都對可吸入化學(xué)物質(zhì)及混合物小動物口鼻暴露方法學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)要求進(jìn)行了詳細(xì)的描述，其中包括對化學(xué)物質(zhì)暴露環(huán)境參數(shù)和濃度的穩(wěn)定性作出了明確的規(guī)定，如下：

指標(biāo) 要求溫度 22±3℃濕度 30%～70%氧濃度 不低于19%二氧化碳濃度 不超過1%濃度穩(wěn)定性和均一性顆粒物濃度變異不超過20%；蒸氣和氣體變異不超過10%

目前嚙齒類動物煙氣吸入暴露的大多數(shù)研究注重生物學(xué)效應(yīng)指標(biāo)，忽視煙氣顆粒物濃度、粒徑分布特征和揮發(fā)性有機(jī)物等暴露特征指標(biāo)，而上述指標(biāo)對煙氣的生物學(xué)效應(yīng)研究至關(guān)重要，因為在動物暴露過程中顆粒物的濃度及其粒徑分布特征直接決定著煙氣在動物肺中的沉積劑量和部位，也決定著機(jī)體對煙氣成份的生物學(xué)效應(yīng)[3-5]。目前在小動物口鼻暴露系統(tǒng)上的方法學(xué)研究鮮有報道，本研究參考OECD測試導(dǎo)則中吸入暴露的技術(shù)要求[6-7]，分析不同稀釋倍數(shù)下4種卷煙煙氣顆粒物和揮發(fā)性有機(jī)物濃度的均一性和穩(wěn)定性，建立了小動物卷煙煙氣口鼻暴露方法，并進(jìn)一步檢測了卷煙煙氣暴露小鼠肺灌洗液（BALF）中炎性因子的變化，以期為進(jìn)一步應(yīng)用暴露系統(tǒng)開展健康效應(yīng)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

材料：市售4種品牌卷煙（2018年2月購自云南昆明當(dāng)?shù)厥袌觯?，分別標(biāo)記為1、2、3和4號，焦油量、煙氣煙堿量和煙氣一氧化碳量如下：

卷煙 焦油/（mg·cig-1）煙氣煙堿/（mg·cig-1）煙氣Co/（mg·cig-1）1 10 1.0 11 2 8 0.8 9 3 8 0.7 9 4 8 0.8 8

抽吸前4種卷煙樣品置于恒溫恒濕箱中，溫度為（22±2）℃，濕度（60±5）%平衡48h；IL-10、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒均購自美國Invitrogen公司；潔凈空氣（80%氮氣，20%氧氣，北京華宇辰氣體有限公司）。

儀器：總揮發(fā)性有機(jī)物氣體分析儀TVA-1000B（FID檢測器1～10000 ppm，美國Thermo科技儀器有限公司）；SMPS 3938 粒徑譜儀（掃描粒徑0.01-1.0μm，美國TSI公司）；十通道轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)（HRHTSM610，北京慧榮和科技有限公司）；小動物口鼻暴露系統(tǒng)（HRH-MNE3026，北京慧榮和科技有限公司，紅外二氧化碳傳感器，電化學(xué)氧濃度傳感器，鉑熱電阻溫度傳感器，氯化鋰電阻式濕度傳感器）；全自動酶標(biāo)儀（ELX-80，美國BioTek）。

1.2 動物

BALB/c小鼠，SPF級，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011，共計110只，雌55只，雄55只，6周齡，體重18～22g，同性別動物體重范圍為平均體重的±20%內(nèi)。動物飼養(yǎng)于匯智泰康生物技術(shù)（北京）有限公司屏障設(shè)施，使用許可證號：SYXK（京）2018-0009，每籠同性別5只，溫度控制在20℃～26℃范圍內(nèi)，相對濕度控制在40%～70%，光照12 h。

1.3 方法

1.3.1 煙氣發(fā)生和口鼻暴露系統(tǒng)

采用ISO 3308—2012將4種品牌卷煙煙氣由十通道轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)分別發(fā)生，每支煙抽吸持續(xù)時間2s，抽吸頻率60s，抽吸容量35.0 mL/2s，抽吸口數(shù)6口，抽吸流量圖為鐘形，最大流量出現(xiàn)在抽吸后的0.8～1.2s之間。煙氣與潔凈空氣（空氣經(jīng)3級HEPA高效過濾后）分別按比例稀釋混勻后進(jìn)入口鼻暴露系統(tǒng)。本試驗根據(jù)前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)煙氣低于15倍稀釋時，口鼻暴露系統(tǒng)二氧化碳高于1%，氧濃度低于19%，動物處于缺氧的狀態(tài)，不符合OECD 吸入毒性測試導(dǎo)則對氧和二氧化碳濃度要求，故以15倍稀釋為起點，2～3倍的組間間距，分別設(shè)置15、50、100和300倍稀釋濃度進(jìn)行檢測。本次試驗采用的口鼻式暴露系統(tǒng)為不銹鋼材質(zhì)，可分為3個模塊，每個模塊分為2層，每層最多可裝載10只大鼠或小鼠，3個模塊最多同時暴露60只動物；每個模塊分別設(shè)置有顆粒物濃度采樣口、顆粒物粒徑檢測采樣口、溫濕度采樣口、氧濃度和二氧化碳檢測采樣口，可根據(jù)染毒動物數(shù)量的需要對3個模塊進(jìn)行組合。裝置內(nèi)缸正壓，外缸微弱負(fù)壓，試驗樣品煙氣由暴露裝置的底部與潔凈空氣渦旋混合后，進(jìn)入內(nèi)缸均勻分散到各暴露口，動物呼出的廢氣與剩余煙氣從暴露裝置頂部抽出后過濾排出，參見示圖1。

1.3.2 試驗設(shè)計

選擇模塊1第1層第1號孔為作為采樣參考孔，每個模塊隨機(jī)選定2個采樣孔，分別命名為A、B、C、D、E和F孔，3個模塊共計6個采樣孔；每天首先測量參考孔，然后依次測量其他采樣孔，重復(fù)測量3次，連續(xù)測量5天。檢測指標(biāo)包括：粒徑分布、顆粒物和TVOC濃度，根據(jù)上述指標(biāo)檢測結(jié)果計算所有采樣孔測量數(shù)據(jù)的變異系數(shù)和參考孔的時間變異系數(shù)，利用公式CV2空間%=CV2總變異%-CV2時間%[5]計算出口鼻暴露系統(tǒng)煙氣分布空間變異系數(shù)。其中時間變異系數(shù)代表暴露期間卷煙煙氣濃度在口鼻暴露系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，空間變異系數(shù)是反映不同暴露孔之間煙氣濃度是否均一，由兩者所組成的總變異的大小決定整個暴露系統(tǒng)煙氣的穩(wěn)定性和均一性。

選擇顆粒物和TVOC濃度均一性和穩(wěn)定性最佳的稀釋倍數(shù)，建立口鼻暴露方法，對40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別進(jìn)行4種卷煙煙氣的暴露，每天每只動物吸入2支煙，連續(xù)14天，同時設(shè)置平行潔凈空氣對照組， 10只動物，給予同等流量的潔凈空氣（由80%氮氣和20%氧氣組成，經(jīng)三級HEPA過濾）。

圖1 口鼻暴露系統(tǒng)剖面圖Fig.1 Cross-section schematic diagram of oro-nasal exposure system

第14d結(jié)束給煙，所有動物用10%水合氯醛按0.9mL/100g bw腹腔注射麻醉，用1mL無菌生理鹽水灌注肺部。將1mL灌洗液300g離心5分鐘，留取上清液-20℃保存。用ELISA方法檢測上清液中IL-10、IL-6和TNF-α含量。

1.3.3 染毒環(huán)境條件的監(jiān)測

染毒期間實時監(jiān)測暴露倉內(nèi)環(huán)境參數(shù)，包括溫度、相對濕度、氧氣濃度、CO2濃度，每隔30min記錄一次數(shù)據(jù)。

1.3.4 顆粒物粒徑分布和濃度檢測

采用TSI SMPS 3938 掃描電遷移率粒徑譜儀，在采樣孔以0.2L/min氣溶膠流量和2.0L/min鞘氣流量采樣，工作液體蒸餾水，采樣1min，分辨率1s，對10-1000nm粒徑范圍內(nèi)顆粒物進(jìn)行自動計數(shù)和粒徑分級，各煙氣每天測量3次，連續(xù)測量5天；每次測量結(jié)束，利用AIM 10.1.0.6（Aerosol Instrument Management）軟件計算顆粒物數(shù)量濃度和擬合分布特征。

1.3.5 TVOC檢測

采用Thermo TVA-1000B總揮發(fā)性有機(jī)物檢測儀，將采樣探頭分別插入采樣孔，以1.0L/min流速采樣，使用氫離子火焰（FID）檢測器，待檢測濃度穩(wěn)定顯示20 s后記錄數(shù)值，各煙氣每天測量3次，連續(xù)測量5天。儀器在測量前用甲烷氣體進(jìn)行200 ppm單點校準(zhǔn)，可檢測范圍1～10000 ppm。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 19.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，對顆粒物數(shù)量中值粒徑、顆粒物數(shù)量濃度和TVOC數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計算，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間差異用單因素方差進(jìn)行分析。P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫濕度、氧和二氧化碳濃度檢測結(jié)果

連續(xù)監(jiān)測暴露倉內(nèi)溫度、濕度、氧氣和二氧化碳濃度，每天記錄3次，連續(xù)監(jiān)測5天，結(jié)果表明染毒過程中4種不同卷煙煙氣分別在不同稀釋比例下溫度在21.2～25.4 ℃之間，相對濕度在40.4%～57.3%之間，氧濃度在21.9%～22.9%之間，二氧化碳濃度0.32%～0.96%之間，均符合OECD吸入毒性暴露倉內(nèi)溫濕度、氧濃度和二氧化碳的要求。其中1:15倍稀釋時暴露倉內(nèi)二氧化碳的濃度在0.75%～0.96%之間，接近1%。

隨著稀釋比例的增加，暴露倉內(nèi)二氧化碳濃度逐步降低，在1:100和1:300稀釋比例時維持在0.28%～0.41%之間，溫濕度和氧氣與稀釋空氣一致。

2.2 不同品牌卷煙主流煙氣粒徑分布特征和揮發(fā)性有機(jī)物檢測結(jié)果

在各稀釋條件下，4種卷煙主流煙氣的粒徑范圍在100nm在700nm之間，各不同粒徑尺寸顆粒物濃度從108～109個/cm3之間變化，與相關(guān)研究結(jié)果相一致[8-12]。15倍稀釋時，由于稀釋倍數(shù)小，每種煙氣的粒徑數(shù)量中值的均值變異系數(shù)高，而在50和100倍稀釋條件下粒徑數(shù)量中值均值相對15倍稀釋數(shù)值變小且變異系數(shù)低，隨著稀釋倍數(shù)的增加未發(fā)生明顯的改變，其主要原因是由于低稀釋倍數(shù)時，顆粒物在暴露倉內(nèi)總體氣流量低，顆粒物在運(yùn)動過程中互相碰撞，撞擊結(jié)合在一起的概率大于分離的概率使顆粒物發(fā)生了團(tuán)聚，導(dǎo)致顆粒物的數(shù)量中值粒徑不穩(wěn)定且大于高稀釋倍數(shù)時的粒徑[13]。由此可以判定，在動物口鼻暴露煙氣時應(yīng)考慮高濃度顆粒物的團(tuán)聚作用，需要對顆粒物進(jìn)行稀釋。隨著稀釋倍數(shù)的增加，顆粒物在暴露倉中撞擊結(jié)合和分離達(dá)到動態(tài)平衡并穩(wěn)定，故顆粒物的粒徑和數(shù)量濃度相對穩(wěn)定。

2.3 主流煙氣顆粒物數(shù)量濃度和TVOC均一性和穩(wěn)定性檢測結(jié)果

4種卷煙主流煙氣分別進(jìn)行15、50、100和300倍潔凈空氣稀釋的情況下，小鼠口鼻暴露時暴露倉不同位置采樣孔，其顆粒物數(shù)量濃度和TVOC濃度在15倍稀釋時時間變異系數(shù)隨著稀釋比例的增高均逐步降低，同時根據(jù)公式CV2空間%=CV2總變異%-CV2時間%計算出主流煙氣稀釋時顆粒物數(shù)量濃度和TVOC空間分布變異系數(shù)，具體數(shù)值見表2。

4種卷煙在15和50倍稀釋時其顆粒物數(shù)量濃度和TVOC時間變異系數(shù)不符合OECD 化學(xué)物質(zhì)吸入毒性試驗導(dǎo)則中對吸入顆粒物濃度時間變化不超過均值的±20%和蒸氣不超過均值±10%的要求，在100和300倍的稀釋情況下，4種卷煙顆粒物和TVOC的時間變異系數(shù)均符合OECD的要求。此外各不同比例的稀釋情況下無論是在同層還是不同層面的采樣孔，顆粒物數(shù)量濃度和TVOC濃度均未見顯著性差異，其中15倍稀釋情況下時間和空間變異最高，50倍次之，100和300倍稀釋相近且最低。由此可見，稀釋氣流參數(shù)的設(shè)置（流量和控制精度）對于煙氣口鼻暴露的時間變異和空間變異具有很大的影響。盡管OECD導(dǎo)則中對空間變異并未做出明確的規(guī)定，結(jié)合以往研究均認(rèn)為蒸氣和氣體物質(zhì)口鼻暴露系統(tǒng)總變異系數(shù)范圍為3%～10%[14-15]。本研究前期試驗發(fā)現(xiàn)低于15倍時口鼻暴露系統(tǒng)中二氧化碳和氧濃度不符合OECD標(biāo)準(zhǔn)，因此以15倍為起點2～3倍間距設(shè)計了50、100和300倍稀釋。若以60kg體重人體為例，每天1～20支煙暴露情況下，根據(jù)《實驗動物和人體每公斤體重等效劑量折算系數(shù)W表》[16]分別計算人與小鼠、大鼠和豚鼠相應(yīng)吸煙支數(shù)轉(zhuǎn)換，20g小鼠稀釋倍數(shù)在17～330倍，200g大鼠在3～50倍，400g豚鼠在2～27倍。而要產(chǎn)生相同的生物學(xué)效應(yīng)或按照符合國家標(biāo)準(zhǔn)的試驗方法，300倍或更高稀釋倍數(shù)比100倍稀釋需要對動物進(jìn)行更長的暴露周期或更多卷煙的消耗，不符合動物試驗的3R原則，即減少、優(yōu)化和替代，且有暴露濃度小于最大無作用劑量（每天小于1支煙或更少），脫離實際生物學(xué)效應(yīng)研究的可能性，因此選擇100倍的稀釋濃度建立卷煙煙氣口鼻暴露方法，也是本次研究不同稀釋倍數(shù)中穩(wěn)定且時間和空間差異小的稀釋比例，符合實際應(yīng)用，詳細(xì)參數(shù)見表3。

表1 不同稀釋倍數(shù)下煙氣顆粒物特征和揮發(fā)性有機(jī)物檢測結(jié)果（n=15）Tab.1 Comparison of count median diameter, number concentration and TVOC of four mainstream cigarette smokes under different dilution ratios （ n=15）

表2 卷煙煙氣顆粒物數(shù)量濃度和TVOC濃度在不同稀釋倍數(shù)時變異系數(shù)檢測結(jié)果（n=15）Tab.2 Coefficient Variation of Particle number concentration and TVOC of typical cigarette smoke under different dilution ratios（n=15）

表3 卷煙煙氣口鼻暴露系統(tǒng)參數(shù)Tab.3 Oro-nasal exposure systme parameters for cigarette smoke exposure

2.4 卷煙煙氣暴露小鼠肺灌洗液中IL-10、IL-6和TNF-α檢測結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)連續(xù)14d暴露，與對照組相比，4種卷煙煙氣小鼠肺灌洗液中促炎性因子IL-6和TNF-α釋放水平增高了近2倍（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表4，與文獻(xiàn)[17-21]結(jié)果相一致。各煙氣暴露組IL-10變異系數(shù)在6.9%～8.6%之間，TNF-α變異系數(shù)在13.4%～17.6%；IL-6變異系數(shù)在16.8%～23.2%之間；盡管各項指標(biāo)變異系數(shù)有所差異（各指標(biāo)靈敏度不同），但均維持較為穩(wěn)定的檢測結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)明顯偏離均值的數(shù)值。故由此可判定，本研究所建立的小動物口鼻暴露方法生物學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果可靠穩(wěn)定。

同時，本研究結(jié)果表明卷煙煙氣可增強(qiáng)肺內(nèi)淋巴細(xì)胞的粘附作用，有助于淋巴細(xì)胞炎性滲出，參與炎性發(fā)展過程；4號卷煙煙氣暴露小鼠灌洗液中TNF-α與其他3種卷煙煙氣相比，釋放水平低近20%（P＜0.05），4號卷煙煙氣TVOC和顆粒物濃度是其他卷煙煙氣均值的約1/4，故可初步判斷TVOC和顆粒物濃度與炎性因子TNF-α間有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系趨勢，但仍需要進(jìn)一步通過設(shè)置更多劑量梯度予以證實；此外，有研究認(rèn)為IL-10是調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的重要細(xì)胞因子[22]。Treg細(xì)胞的抑制作用主要是通過分泌IL-10等細(xì)胞因子參與[23]，本次研究抑制因子IL-10釋放水平與對照組相比，未見顯著性差異，說明4種卷煙煙氣均未引起肺Treg細(xì)胞的損傷。

表4 卷煙煙氣100倍稀釋后對小鼠肺灌洗液IL-10、IL-6和TNF-a釋放水平的影響（n=10，pg/mL）Tab.4 Release level of IL-10, IL-6 and TNF after diluting four mainstream cigarette smokes 100 times

3 結(jié)論

口鼻暴露倉內(nèi)主流煙氣的顆粒物粒徑尺寸主要分布在100～700nm之間，呈正態(tài)分布，各不同粒徑尺寸顆粒物數(shù)量濃度從108～109個/cm3之間變化。

本研究建立了卷煙煙氣口鼻暴露方法，使每只動物吸入的主流煙氣無論是顆粒物的粒徑特征還是數(shù)量濃度以及TVOC濃度均一性和穩(wěn)定性均達(dá)到OECD測試導(dǎo)則中的要求，經(jīng)生物學(xué)效應(yīng)指標(biāo)的驗證，所用方法結(jié)果穩(wěn)定可靠。