生防菌株LB-1對煙草白粉病的抑制效果及對病菌孢子萌發(fā)的影響

劉彩云，許瑞瑞，劉春香

濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院“十三五”山東省高等學(xué)校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊 261061

煙草白粉病是由二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）[1-2]或奧隆特高氏白粉菌（Golovinomyces orontii）[3]侵染引起的病害。兩種白粉病菌都可通過分生孢子產(chǎn)生初生芽管、附著胞，并以吸器從寄主細(xì)胞獲取營養(yǎng)物質(zhì)從而導(dǎo)致煙草葉片枯黃、整株枯死、調(diào)制后缺乏彈性和香氣[2-4]。目前我國煙草白粉病防治以化學(xué)防治為主，生防菌研究較少。已報(bào)道的對煙草白粉病具有生防效果的微生物有云芝菌（Coriolus versicolor）[5]、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）[6]、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）[7]、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）[8]等。

毛殼菌（Chaetomium spp.）是一類極具生防潛力的真菌類群[9]，被報(bào)道具有生防作用的有球毛殼（C.globosum）[10-12]、螺旋毛殼（C.spirale）[13]、角毛殼（C.cupreum）[14]等，但毛殼菌應(yīng)用于煙草白粉病防治的研究鮮有報(bào)道。本研究前期篩選獲得一株近緣毛殼菌株LB-1，該菌株對多種植物病原真菌都具有很好的拮抗作用[15]。本文以白粉病感病煙草品種中煙90[4]為供試材料，研究了LB-1對煙草白粉病的抑制效果及對病菌分生孢子萌發(fā)的影響，為煙草白粉病的生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中煙90種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（20%土豆煎汁、2%葡萄糖、2%瓊脂粉）培養(yǎng)生防菌株LB-1，采用馬鈴薯葡萄糖液態(tài)（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基（20%土豆煎汁、2%葡萄糖）振蕩培養(yǎng)獲得LB-1發(fā)酵液，采用瓊脂保鮮培養(yǎng)基（0.6%苯并咪唑，2%瓊脂粉）培養(yǎng)煙草離體葉段。

1.2 方法

1.2.1 盆栽煙苗的培育、接種

中煙90種子催芽后播種于育苗盤中，隔離培育（17～25℃，自然光照）至成苗期后移栽到小花盆中。煙苗隔離培養(yǎng)7 d后采用孢子沉降法接種煙草白粉病菌，即放置盆栽苗于接種筒底部，將預(yù)先繁殖的新鮮煙草白粉病菌通過黑色紙卷從接種筒上部吹入，使病菌孢子散落在接種筒底部的盆栽苗上。

1.2.2 菌株LB-1菌懸液和發(fā)酵液的制備

刮取PDA平板上預(yù)先培養(yǎng)的LB-1菌絲體，用無菌生理鹽水稀釋為1×105cfu/mL的菌懸液；以體積比1:10的比例接于PDB培養(yǎng)液中，25℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)液經(jīng)雙層紗布過濾，4℃、12000 r/min條件下離心15 min，上清液即為LB-1發(fā)酵液。

1.2.3 菌株LB-1對煙草白粉病的抑制作用

盆栽苗測定：煙草盆栽苗在接種白粉病菌前和接種后24 h分別葉面噴施LB-1發(fā)酵液和菌懸液各1次（每株煙苗噴施20 mL），繼續(xù)隔離培養(yǎng)（17～25℃，自然光照）至對照植株葉片充分發(fā)病后，參照國標(biāo)煙草病蟲害分級及調(diào)查方法[16]分析并計(jì)算病情指數(shù)和防效。每一處理設(shè)15盆煙苗（每盆1株）。調(diào)查時(shí)每個(gè)植株從頂部第3個(gè)葉片開始，向下取3個(gè)葉片。對照植株接種前和接種后24 h分別用無菌蒸餾水噴施一次（每株煙苗噴施20 mL）。

離體葉段測定：剪取健康煙草植株主脈兩側(cè)的葉片組織，在菌株LB-1發(fā)酵液和菌懸液中分別浸蘸后，正面朝上放置在瓊脂保鮮培養(yǎng)基平板上，孢子沉降法接種后培養(yǎng)8 d（22℃，12 h光照），調(diào)查離體葉段上的病斑數(shù)，計(jì)算抑制率[17]。每個(gè)處理設(shè)9皿，每皿2個(gè)葉段。為使LB-1菌懸液和發(fā)酵液在煙草葉片上更好的附著，LB-1發(fā)酵液和菌懸液中分別加入了0.03%的吐溫20[18]，并在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置0.03%吐溫20處理，對照為無菌蒸餾水處理。

1.2.4 菌株LB-1發(fā)酵液對白粉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

采用孢子沉降法接種煙草白粉病菌于薄層PDA平板，每皿噴施LB-1發(fā)酵液1 mL，22℃、自然光照下培養(yǎng)。2 h、18 h后培養(yǎng)皿直接置于相差顯微鏡下觀察白粉病菌孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，并觀察孢子和芽管的形態(tài)。處理和對照各設(shè)5個(gè)培養(yǎng)皿的重復(fù)，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率時(shí)每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)取3個(gè)視野，每視野萌發(fā)孢子占總觀察孢子的比例為萌發(fā)率。孢子初生芽管長度超過孢子體一半即視為萌發(fā)。對照為無菌水處理。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 8.1對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著差異法（LSD）檢驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LB-1對煙草白粉病的抑制作用

菌株LB-1對煙草盆栽苗和離體葉段白粉病的抑制作用檢測結(jié)果如表1、表2所示。LB-1菌懸液葉面處理對煙草白粉病發(fā)生無明顯影響，但LB-1發(fā)酵液能顯著降低中煙90葉片白粉病的發(fā)生程度，煙草盆栽苗和離體葉段上的防效和抑制率分別為44.90%和53.11%。0.03%吐溫20作用效果甚微。

表1 LB-1菌懸液和發(fā)酵液對煙草盆栽苗白粉病發(fā)生的影響Tab.1 Effects of LB-1 suspension and culture broth on tobacco powdery mildew in pot seedlings

表2 LB-1菌懸液和發(fā)酵液對煙草離體葉段白粉病發(fā)生的影響Tab.2 Effects of LB-1 suspension and culture broth on tobacco powdery mildew in detached-leaf segments

2.2 菌株LB-1發(fā)酵液對煙草白粉病菌孢子萌發(fā)的抑制

接種在薄層PDA平板上的煙草白粉病菌孢子經(jīng)LB-1發(fā)酵液噴施處理后，對孢子萌發(fā)影響不明顯，發(fā)酵液和對照處理的孢子萌發(fā)率分別為81.79%和89.70%，但發(fā)酵液處理的孢子體出現(xiàn)了皺縮畸形（圖1A），而對照無菌水處理的孢子則表現(xiàn)正常（圖1B）；18 h時(shí)，LB-1發(fā)酵液處理的孢子雖然萌發(fā)產(chǎn)生了芽管，但是芽管短，有的出現(xiàn)了分叉，孢子體皺縮畸形（圖1C），而對照無菌水處理的孢子則發(fā)育正常，形成了附著孢（圖1D）。

圖1 菌株LB-1發(fā)酵液處理的煙草白粉病菌孢子萌發(fā)特點(diǎn)Fig.1 Characteristics of conidia germination of E.cichoracearum DC treated by LB-1 culture broth

3 討論

蔡琳等[8]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌第2次和第3次葉面處理后對煙草白粉病田間防效分別為44.93%和71.58%；而王靜等[6]研究發(fā)現(xiàn)，短小芽孢桿菌AR03不同濃度菌懸液處理對煙草白粉病的防治效果也存在顯著差異。本研究中近緣毛殼菌株LB-1發(fā)酵液在接種白粉病菌前后葉面處理煙草盆栽苗2次，可獲得44.90%的防效，與蔡琳等[8]測定的枯草芽孢桿菌作用效果相當(dāng)。

LB-1發(fā)酵液能夠引起煙草白粉病菌孢子皺縮，芽管發(fā)育畸形，這表明發(fā)酵液中含有影響病菌孢子生長發(fā)育的活性物質(zhì)，但活性物質(zhì)及其作用機(jī)理還有待于明確。LB-1菌懸液對煙草白粉病菌無明顯生防效果，這表明LB-1菌體與煙草白粉病菌無直接互作，但LB-1是否能夠通過定殖煙草葉片發(fā)揮生防作用還有待于進(jìn)一步檢測。