抗纖靈對(duì)慢性腎衰竭小鼠心臟TGF-β1/Smad通路的影響

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慢性腎衰竭(CRF)是所有的慢性腎臟疾病(CKD)發(fā)展的最終結(jié)局，從病理上講，包括腎小球及腎血管的硬化和腎間質(zhì)纖維化。近年來，慢性腎衰竭的發(fā)病率正呈現(xiàn)逐年升高趨勢，而心血管疾病占慢性腎衰竭病人死亡原因的50%以上[1]，心血管疾病病理上的突出表現(xiàn)為左心室肥厚、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等[2]。因此，如何積極控制并延緩腎衰竭的進(jìn)展和改善心血管并發(fā)癥成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。雖然血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑在這方面有一定的作用，但對(duì)于腎功能進(jìn)行性惡化和終末期腎衰竭病人的應(yīng)用受到了限制。本研究擬觀察抗纖靈對(duì)慢性腎衰竭小鼠心臟轉(zhuǎn)移生長因子-β1(TGF-β1)/Smad通路的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)8周齡C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.1.2 藥物與試劑 抗纖靈組方：桃仁12 g，丹參15 g，當(dāng)歸12 g，酒大黃 9 g，懷牛膝15 g。由曙光醫(yī)院中藥房提供，煎煮20～25 min。纈沙坦膠囊(每粒80 mg)，北京諾華制藥有限公司。Trizol Reagent總RNA抽提試劑盒購自美國Invitrogen公司，實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKara公司，Masson染色試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.1.3 儀器 石蠟切片機(jī)(德國LEICA公司)、冷凍高速離心機(jī) (德國Eppendorf公司)、顯微鏡及成像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)、ViiA 7型實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國ABI公司生產(chǎn))。

1.2 方法 按Platt法建立慢性腎衰竭小鼠模型：小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)將小鼠分為假手術(shù)組(8只)和手術(shù)組(27只)，以2%戊巴比妥鈉 0.07～0.08 mL進(jìn)行小鼠腹腔注射，小鼠麻醉后取右側(cè)臥位充分暴露左腎區(qū)，沿左肋脊下緣 1.5 cm 處消毒做斜向切開皮膚及肌層，在腹膜后取出左腎，剝離周圍組織及腎包膜，再做弧形切口主要切除腎皮質(zhì)，明膠海綿止血，縫合肌層及皮膚。7 d后再進(jìn)行右腎全切除。假手術(shù)組只剝離左右腎包膜，術(shù)后2周眼眶采血測血肌酐，觀察模型是否成功。

造模成功后，隨機(jī)將手術(shù)組小鼠分為模型組(9只)、纈沙坦組(9只)、抗纖靈組(9只)。抗纖靈組予抗纖靈方煎劑0.5 mL 灌胃，藥物濃度為20 g/kg ，每日1次；纈沙坦組予纈沙坦0.5mL灌胃，藥物濃度為20mg/kg，每日 1次；模型組和假手術(shù)組均予等量蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃22周。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，模型組及抗纖靈組各剩6只，纈沙坦組、假手術(shù)組剩7只。

1.3 取材 各組小鼠眼球摘除取血后，迅速剪開胸廓，取心臟，生理鹽水洗凈，吸干多余水分，剪取一部分左心室放入4%多聚甲醛中行Masson染色并計(jì)算膠原面積；剩余部分心臟放入冷存管，存放于-80 ℃冰箱備用。

1.4 心臟膠原面積的比較 Masson染色示小鼠的心肌纖維呈紫紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。每張切片隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野，用Image Pro6圖像分析軟件進(jìn)行分析，比較每組心臟膠原面積占整個(gè)視野的百分比。

1.5 小鼠心臟組織TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA的表達(dá) 從-80 ℃冰箱中取出小鼠心臟組織，根據(jù)Trizol說明書進(jìn)行RNA的抽提，用紫外分析測定所需提取2 μg的RNA體積，加DEPC水補(bǔ)足體積至8 μL。在 PCR管中依次加入： 5×RT buffer 0.8 μL，Inhibitor 0.4 μL，10 mmol/L dNTP mix 0.4 μL，Transcriptase 0.4 μL，使最終體積為 10 μL。在 PCR體系中依次加入(冰上操作)： 梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品或RT產(chǎn)物1 μL， SYBR premix ex taq 10 μL，RT Primer Mix 1 μL，RNase Free dH2O 7.6 μL，RoxII 0.4 μL，總體積20 μL。用熒光定量專用的PCR封口膜覆蓋 96孔 PCR板，瞬時(shí)離心后放入熒光定量 PCR儀內(nèi)，設(shè)定反應(yīng)條件： 95 ℃ 15 s預(yù)變性，95 ℃5 s變性，60 ℃30 s退火，40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)溶解曲線判斷 PCR反應(yīng)的特異性。引物信息：TGF-β1上游CCACCTGCAAGACCATCGAC，下游CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC，產(chǎn)物長度91；Smad3 上游ACTAACTTCCCTGCTGGCAT，下游ACTGGCTGTAGGTCCAAGT，產(chǎn)物長度183；SMAD7上游CTCTGTGAACTAGAGTCTCCCC下游GCTCCAGAAGAAGTTGGGAATC，產(chǎn)物長度163。以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)小鼠心臟膠原面積的影響 與假手術(shù)組比較，模型組的小鼠心臟膠原面積顯著增大(P<0.01)，抗纖靈組和纈沙坦組與模型組比較，心臟膠原面積顯著縮小(P<0.01)，且抗纖靈組與纈沙坦組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1。

表1 各組小鼠心臟膠原面積的比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01

2.2 對(duì)小鼠心臟組織TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)水平的影響 模型組TGF-β1、Smad3 mRNA與假手術(shù)組比較顯著升高(P<0.01)，模型組Smad7 mRNA與假手術(shù)組比較顯著降低(P<0.01)。治療后與模型組比較，抗纖靈組及纈沙坦組能顯著降低TGF-β1mRNA的表達(dá)(P<0.01)，降低Smad3 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，抗纖靈組與纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)治療，抗纖靈組及纈沙坦組Smad7 mRNA與模型組比較有顯著上升(P<0.01)，兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠心臟組織TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

3 討 論

慢性腎衰竭病人心血管疾病的發(fā)生率是患腎臟疾病腎正常者的5～10倍，主要表現(xiàn)為心室肥大、心肌缺血、心力衰竭和心源性猝死。美國高血壓聯(lián)合報(bào)告中已明確將腎臟疾病列為心血管疾病的獨(dú)立高危因素[3]。慢性腎衰竭引起的心血管疾病與貧血、電解質(zhì)紊亂、微炎癥狀態(tài)、氧化應(yīng)激、局部腎素-血管緊張素激活、TGF-β1/Smad通路等多種因素有關(guān)。西醫(yī)的治療主要為擴(kuò)血管、對(duì)癥處理、透析和移植等。

慢性腎衰竭在中醫(yī)學(xué)上并無此病名，根據(jù)其主要表現(xiàn)可歸屬于“溺毒”“關(guān)格”“水腫”等范疇；而慢性腎衰竭引起的心臟病變又隸屬于“心悸”“胸痹”等范疇。何立群教授認(rèn)為本病的中醫(yī)病機(jī)為腎氣虧虛、瘀血阻絡(luò)，瘀濁內(nèi)停而循經(jīng)上犯，心脈瘀阻致心失所養(yǎng)，日久發(fā)而為病。確立了活血化瘀、補(bǔ)腎瀉濁的治療方法，方選抗纖靈扶正泄?jié)?，攻補(bǔ)兼施?？估w靈方中丹參性微寒，歸心、肝經(jīng)，補(bǔ)血活血；牛膝性平，歸肝、腎經(jīng)，補(bǔ)腎活血；桃仁性平，歸心肝、大腸經(jīng)，祛瘀活血；酒大黃性寒，歸脾胃、大腸、心、肝經(jīng)，清熱瀉濁活血，當(dāng)歸性溫，歸心、肝、脾經(jīng)，補(bǔ)血活血。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗纖靈能抑制慢性腎衰竭大鼠腎組織TGF-β1/Smad通路的過度表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)增生和積聚，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，具有改善腎纖維化和保護(hù)腎功能的作用[4]。那么抗纖靈組方能否通過改善腎功能而減輕或預(yù)防腎功能不全引起的諸如心肌纖維化等心臟病變，有待更深入的研究。

作為國際公認(rèn)的促纖維化生長因子TGF-β1，可促進(jìn)心肌細(xì)胞和腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的合成與沉積，并通過Smad通路等加重心、腎纖維化的過程[5]。Smad 家族被認(rèn)為參與了多種原發(fā)性和繼發(fā)性心臟疾病的生理病理過程，它是 TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)通路里重要的效應(yīng)因子，可被TGF-β1通過細(xì)胞膜表面受體啟動(dòng)，然后將信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)，能調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄從而誘導(dǎo)其下游因子的表達(dá)。研究表明作為TGF-β1下游因子的Smad3被激活后能通過促進(jìn)心肌纖維化引起心室重構(gòu)[6]。在心室長期處于壓力超負(fù)荷的情況下，Smad3作用增強(qiáng)，而Smad7作用減弱，這些都促進(jìn)了TGF-β1致心肌纖維化和心室重構(gòu)的發(fā)展[7]。Smad7可抑制心肌成纖維細(xì)胞膠原蛋白的合成，作為抑制型Smad，它與TGF-β受體復(fù)合物中的TGFβRI競爭性結(jié)合，阻斷Smad2、Smad3的信號(hào)傳導(dǎo)過程，抑制心室重構(gòu)。除此之外，Smad7 還能與相對(duì)應(yīng)的效應(yīng)元件結(jié)合，通過分解 TGF-β1誘導(dǎo)的 Smad-DNA 復(fù)合物等方式起到抑制信號(hào)通路的作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的小鼠心臟膠原面積較假手術(shù)組顯著增大，提示心肌間質(zhì)出現(xiàn)了明顯的纖維化，由此可見，慢性腎衰竭引起心臟病變的造模是成功的。抗纖靈治療后小鼠心臟膠原面積得到了明顯改善，表明抗纖靈能改善心肌纖維化，從而影響慢性腎衰竭引起的心臟重構(gòu)。纈沙坦是特異性AT1受體拮抗劑，能阻斷血管緊張素Ⅱ而具有抗細(xì)胞增殖和纖維化的效應(yīng)。在抗心肌纖維化方面，抗纖靈組與纈沙坦組比較，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示抗纖靈與纈沙坦療效相當(dāng)。治療后抗纖靈組的TGF-β1、Smad3 mRNA較模型組下調(diào)，Smad7 mRNA顯著上調(diào)，與纈沙坦比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該方能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路發(fā)揮抗心肌纖維化的效果。

綜上所述，抗纖靈具有對(duì)抗慢性腎衰竭引起的心肌纖維化作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1和Smad3 mRNA的表達(dá)、上調(diào)Smad7 mRNA的表達(dá)有關(guān)。