基于香氣成分氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜的判別分析和相似度評(píng)價(jià)用于綠茶等級(jí)差異研究

龍立梅, 宋沙沙, 曹學(xué)麗

(北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心, 北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100048)

我國(guó)是綠茶生產(chǎn)大國(guó),在綠茶的流通和貿(mào)易領(lǐng)域,急需對(duì)其品質(zhì)的科學(xué)評(píng)定方法。目前主要采用的是感官審評(píng)的方法,但該方法對(duì)品茶師的經(jīng)驗(yàn)依賴性較強(qiáng),容易出現(xiàn)主觀偏差,執(zhí)行中也存在不規(guī)范、不嚴(yán)格等問題。因而茶葉市場(chǎng)分級(jí)混亂,存在以次充好的情況。

在茶葉的感官評(píng)審中,香氣對(duì)茶葉感官品質(zhì)的貢獻(xiàn)率達(dá)25%～35%[1],因此茶葉香氣成分研究意義重大。指紋圖譜技術(shù)主要應(yīng)用于鑒別中藥真?zhèn)魏唾|(zhì)量控制等,茶葉科研人員借鑒該方法,利用高相液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、紅外及近紅外光譜(IR-NIR)、核磁共振(NMR)等技術(shù),得到能夠標(biāo)示茶葉品質(zhì)特征成分的譜圖;然后運(yùn)用多種數(shù)據(jù)信息處理技術(shù)對(duì)指紋圖譜進(jìn)行分析,從而對(duì)茶葉品質(zhì)做出客觀量化的評(píng)價(jià),有效彌補(bǔ)“感官審評(píng)”的缺陷[2]。目前茶葉指紋圖譜技術(shù)已用于茶葉的品種鑒別,茶葉原料、半成品及成品茶的質(zhì)量評(píng)價(jià)等[3-5],但是還沒有在茶葉分等定級(jí)中應(yīng)用的報(bào)道。

信陽(yáng)毛尖茶是我國(guó)十大名茶之一,具有淡雅、清新的清香,并且香氣持久,是河南省著名的地理標(biāo)志產(chǎn)品之一[6]。本研究以信陽(yáng)毛尖為研究對(duì)象,以茶湯香氣成分為研究目標(biāo),采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),通過建立綠茶香氣成分GC-MS指紋圖譜,將判別分析法與指紋圖譜相似度法相結(jié)合,用以研究不同等級(jí)茶樣之間的差異性,并用于茶樣的等級(jí)判別,為綠茶品質(zhì)評(píng)價(jià)和質(zhì)量監(jiān)控提供了一種科學(xué)量化的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

供試茶樣為當(dāng)年4～5月的信陽(yáng)毛尖茶,均來(lái)自信陽(yáng)市文新茶葉有限責(zé)任公司,包括優(yōu)質(zhì)信陽(yáng)毛尖茶“道”系列4個(gè)等級(jí)多個(gè)批次的22個(gè)茶樣,按等級(jí)從高到低依次為觀道(5個(gè)批次)、悟道(5個(gè)批次)、修道(6個(gè)批次)和品道(6個(gè)批次);普通信陽(yáng)毛尖茶“300”系列3個(gè)等級(jí)多個(gè)批次的19個(gè)茶樣,按等級(jí)從高到低依次為“330”(6個(gè)批次)、“320”(7個(gè)批次)和“310”(6個(gè)批次)。用復(fù)合鋁箔袋密封樣品,保存于4 ℃冰箱中,冷藏待用。正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)樣品(C7～C40),購(gòu)至上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

QP 2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司);手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 57328-U萃取頭(美國(guó)Supelco公司); HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1GC-MS指紋圖譜建立方法

參照中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23776-2009[1]沖泡綠茶的程序,準(zhǔn)確稱取茶葉樣品3.0 g,放入200 mL的三角瓶?jī)?nèi),倒入150 mL沸水,用錫箔紙封口,室溫下靜置5 min,待茶葉香氣充分揮發(fā)和平衡。首先將其置于80 ℃恒溫水浴鍋中,同時(shí)將已經(jīng)老化15 min的萃取頭插入三角瓶?jī)?nèi)茶湯的上方,將固相微萃取(SPME)的手柄固定好,推出萃取頭并開始計(jì)時(shí),頂空吸附60 min后取出,立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口,在250 ℃條件下熱脫附5 min,進(jìn)行GC-MS檢測(cè)[7]。每份信陽(yáng)毛尖茶樣品均做5針平行實(shí)驗(yàn)。將所獲得的同一等級(jí)的GC-MS總離子流圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(版本2012.130723),生成相應(yīng)等級(jí)茶葉的GC-MS對(duì)應(yīng)指紋圖譜。

GC-MS分析條件如下。Rxi-5 MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:初始溫度為40 ℃,保持3 min,以4 ℃/min速率升到80 ℃,保持2 min,再以2 ℃/min速率升到160 ℃,不保持,最后以12 ℃/min速率升到250 ℃,保持3 min,升溫程序結(jié)束;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;載氣:高純He(純度99.999%);柱流量:1.0 mL/min;采用不分流進(jìn)樣方式。EI電離源;離子源溫度為200 ℃;離子化電壓為70 eV;質(zhì)譜掃描范圍m/z35～450;檢測(cè)器為1.00 kV。在同樣的條件下,對(duì)正構(gòu)烷烴混合物進(jìn)行分析,獲得各個(gè)正構(gòu)烷烴成分的保留時(shí)間。

1.2.2香氣成分的分析及特征成分的篩選

對(duì)總離子色譜圖(total ion chromatogram, TIC)各峰積分,積分參數(shù)斜率為5 000/min,半峰寬為2 s,變參時(shí)間為1 000 min;得到的色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST(US National Institute of Standards and Technology)質(zhì)譜庫(kù)匹配,挑選出與目標(biāo)物質(zhì)匹配度≥80的色譜峰,并將各峰測(cè)定的保留指數(shù)與NIST譜庫(kù)提供的保留指數(shù)(RI)進(jìn)行比較,個(gè)別與文獻(xiàn)值比較,確定各個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)物質(zhì)的名稱。用各色譜峰的峰面積與總峰面積之比計(jì)算出各香氣組分的相對(duì)含量。

保留指數(shù)的計(jì)算采用以下公式:

(1)

式中,RI是待測(cè)組分的保留指數(shù);RTunknown是待測(cè)組分的保留時(shí)間;RTn、RTn+1分別是待測(cè)組分前后正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間;n為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)。

綠茶的香氣是其所含的不同芳香物質(zhì)以不同濃度組合的綜合表現(xiàn);一般情況下,含量較多的成分對(duì)香氣的貢獻(xiàn)較大,而相對(duì)含量較少的物質(zhì)未必對(duì)香氣的貢獻(xiàn)較少[8,9]。因此,分別對(duì)不同批次、不同等級(jí)信陽(yáng)毛尖茶檢出的所有香氣成分進(jìn)行匯總、分類和篩選,從而確定信陽(yáng)毛尖茶的共有峰作為香氣指紋圖譜的特征峰,建立特征香氣共有峰指紋圖譜。所篩選出的香氣特征成分總量在檢出的香氣物質(zhì)總量中均達(dá)到70%以上,具有一定的代表性,可以反映指紋圖譜的特征信息。

1.2.3不同等級(jí)信陽(yáng)毛尖茶的判別分析

以信陽(yáng)毛尖茶2個(gè)系列7個(gè)等級(jí)樣品為研究對(duì)象,采用判別分析法對(duì)41個(gè)茶樣進(jìn)行等級(jí)判別。所得到的每個(gè)樣品色譜圖中,以最大主峰為參照,計(jì)算相對(duì)峰面積,以7個(gè)等級(jí)41個(gè)樣本的23個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積作為原始數(shù)據(jù),采用SPSS 20.0軟件,使用步進(jìn)式方法中的Wilks λ法進(jìn)行逐步判別分析,建立判別方程,并對(duì)所建立的判別方程進(jìn)行交叉驗(yàn)證分析,驗(yàn)證判別方程對(duì)初識(shí)分組的分類結(jié)果[7,10-12]。

1.2.4相似度計(jì)算方法的選擇

相比于綠茶在產(chǎn)地、種類上的差異,同種綠茶的不同等級(jí)之間的差異判別屬于小類水平上的區(qū)別,其茶湯香氣成分的物質(zhì)種類大多數(shù)相同,差異主要體現(xiàn)在物質(zhì)成分的含量上。所以選擇適合同種綠茶不同等級(jí)的相似度計(jì)算方法是體現(xiàn)差異的關(guān)鍵。綜合考慮現(xiàn)有多種相似度計(jì)算方法后,本文選擇了夾角余弦法[13]、相關(guān)系數(shù)法[14]、新模型負(fù)指數(shù)法[15]、改進(jìn)Nei系數(shù)法[16]、改良程度相似度[17]、新改良程度相似度[18]六種計(jì)算方法,進(jìn)行同種綠茶不同等級(jí)之間相似度計(jì)算,這六種方法對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式如式(2)～(7)所示。

(2)

(3)

改進(jìn)的Nei系數(shù)法[15]:

(4)

(5)

(6)

(7)

以優(yōu)質(zhì)信陽(yáng)毛尖“道”系列和普通信陽(yáng)毛尖“300”系列7個(gè)等級(jí)多個(gè)批次樣品的23個(gè)特征滋味成分的GC-MS平均峰面積為計(jì)算參數(shù),利用Excel軟件的數(shù)據(jù)處理功能,以最高級(jí)別觀道茶樣指紋圖譜為參比,將各級(jí)茶樣的23個(gè)特征峰的平均峰面積分別代入6種相似度計(jì)算方法的公式中,得到各等級(jí)茶樣與最高級(jí)別觀道茶樣的指紋圖譜的相似度。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法重現(xiàn)性考察

方法的重現(xiàn)性是在相同測(cè)量條件下,對(duì)同一被測(cè)量樣品進(jìn)行連續(xù)多次測(cè)量后所得結(jié)果之間的一致性,是衡量實(shí)驗(yàn)方法可行性和適用性的重要指標(biāo)。將同一茶樣在相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)分析5次,測(cè)定結(jié)果顯示,色譜峰保留時(shí)間的RSD均小于0.1%。相對(duì)峰面積的RSD,除個(gè)別含量較低的色譜峰為10.0%左右,絕大多數(shù)均小于10.0%。結(jié)果說(shuō)明重現(xiàn)性好,符合指紋圖譜建立的指標(biāo)要求。

圖 1 信陽(yáng)毛尖茶“道”系列4個(gè)等級(jí)和“300”系列3個(gè)等級(jí)的GC-MS指紋圖譜Fig. 1 GC-MS fingerprints of four grades of “Dao” series and three grades of “300” series of Xinyang Maojian tea

2.2 各等級(jí)信陽(yáng)毛尖茶香氣GC-MS指紋圖譜的建立

分別建立了信陽(yáng)毛尖茶“道”系列4個(gè)等級(jí)和“300”系列3個(gè)等級(jí)的香氣成分GC-MS指紋圖譜。圖1中“道”系列4個(gè)等級(jí)指紋圖譜對(duì)比圖,自上而下依次為觀道、悟道、修道和品道;300”系列3個(gè)等級(jí)指紋圖譜對(duì)比圖,自上而下依次為“330”“320”和“310”。

表 1 信陽(yáng)毛尖茶23個(gè)特征香氣成分Table 1 23 characteristic aroma components of Xinyang Maojian tea

2.3 信陽(yáng)毛尖茶香氣特征成分的確定

根據(jù)信陽(yáng)毛尖多個(gè)批次、不同等級(jí)的41個(gè)樣品的指紋圖譜,篩選共有峰。41個(gè)茶樣中均含有23個(gè)主要揮發(fā)性成分(見表1)。所篩選的23個(gè)揮發(fā)性成分總量占信陽(yáng)毛尖茶總揮發(fā)性成分的70%以上,具有一定的代表性,可以反映指紋圖譜的特征信息。

圖 2 基于GC-MS指紋圖譜的信陽(yáng)毛尖茶“道”系列和“300”系列等級(jí)判別分析Fig. 2 Discriminant classification of Xinyang Maojian tea “Dao” series and “300” series based on GC-MS fingerprints

2.4 基于香氣特征成分的信陽(yáng)毛尖茶等級(jí)判別分析

以信陽(yáng)毛尖茶“道”系列22個(gè)樣本和“300”系列19個(gè)樣品的23個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為原始數(shù)據(jù),利用SPSS 20.0軟件建立典型判別函數(shù),對(duì)41個(gè)樣本的等級(jí)區(qū)分正確率為98%。由如圖2可知,兩個(gè)系列之間及同一系列內(nèi)不同等級(jí)茶樣之間都能實(shí)現(xiàn)很好的判別區(qū)分。對(duì)“道”系列22個(gè)樣品和“300”系列19個(gè)樣品,分別按相同方法分別進(jìn)行判別分析,對(duì)初始分組樣品的等級(jí)區(qū)分判別正確率均為100%,如圖3所示。分系列進(jìn)行判別分析,等級(jí)之間的區(qū)分度更加顯著。結(jié)果表明,采用香氣特征成分可以對(duì)信陽(yáng)毛尖茶樣進(jìn)行很好的等級(jí)判別。

表 2 信陽(yáng)毛尖茶“道”和“300”系列GC-MS指紋圖譜相似度計(jì)算Table 2 Similarity calculation of GC-MS fingerprints for “Dao” series and “300” series of Xinyang Maojian tea

圖 3 分別基于GC-MS指紋圖譜的信陽(yáng)毛尖茶“道”系列和“300”系列等級(jí)判別分析Fig. 3 Discriminant classification of Xinyang Maojian tea “Dao” series and “300” series based on GC-MS fingerprints separately

2.5 不同等級(jí)信陽(yáng)毛尖茶GC-MS指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)不僅可以反映不同等級(jí)綠茶之間的差異,還可以體現(xiàn)出差異程度的大小,以量化形式表達(dá)等級(jí)之間的差異。以信仰毛尖茶最高級(jí)別觀道茶樣指紋圖譜為參照,以6種相似度計(jì)算方法計(jì)算7個(gè)等級(jí)茶樣的相似度,結(jié)果如表2所示。從中可以看出,不同的相似度計(jì)算方法均可以在不同程度上反映等級(jí)之間的差距,但是其中夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、改進(jìn)Nei系數(shù)法3種方法反映出的等級(jí)之間的差異區(qū)分度不顯著。從多種相似度計(jì)算方法所得結(jié)果可知,整體上優(yōu)質(zhì)“道”系列茶樣與普通“300”系列茶樣之間有較大的區(qū)分。對(duì)于優(yōu)質(zhì)“道”系列4個(gè)等級(jí)的茶樣,隨著茶葉品質(zhì)從觀、悟、修、品逐級(jí)降低,其相似度也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),且以新改良的相似度法區(qū)分度最大。從相似度數(shù)據(jù)可以看出,與頂級(jí)的觀道茶相比,悟、修、品級(jí)茶在香氣成分上有顯著的差異,三者之間的差異可以區(qū)分等級(jí),但并不顯著。對(duì)于普通的“300”系列3個(gè)等級(jí)茶樣,其相似度值與優(yōu)質(zhì)“道”系列茶樣,尤其是前3個(gè)等級(jí)的差異較顯著。其3個(gè)等級(jí)之間存在一定的差異性,但差異程度較小,且出現(xiàn)等級(jí)交錯(cuò)現(xiàn)象。這可能是由于“300”系列茶樣整體級(jí)別較低,等級(jí)區(qū)分度較小,感官審評(píng)不易區(qū)分或分級(jí)不嚴(yán)格。

指紋圖譜相似度的大小可以反映該各等級(jí)茶樣與最高的參比等級(jí)的相似程度。相似度數(shù)值越小,相似程度越低。從計(jì)算結(jié)果可以看出,不同等級(jí)茶樣與參比等級(jí)茶樣指紋圖譜的相似度值與茶樣所定的等級(jí)之間具有較好的相關(guān)性,相似度差異越大,茶樣等級(jí)越低。

3 結(jié)論

以信陽(yáng)毛尖茶“道”系列和“300”系列共7個(gè)不同等級(jí)41個(gè)樣品為主要研究對(duì)象,分別建立了每個(gè)等級(jí)茶樣的香氣GC-MS指紋圖譜,以篩選的23個(gè)香氣特征成分的相對(duì)含量為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行判別分析。結(jié)果顯示,該方法能夠很好地體現(xiàn)出信陽(yáng)毛尖茶兩個(gè)系列不同等級(jí)之間的差異性,在各系列茶樣內(nèi)判別分析的區(qū)分度更高。說(shuō)明采用基于香氣成分GC-MS指紋圖譜特征成分的判別分析,可以對(duì)同一品種不同等級(jí)茶樣進(jìn)行很好的等級(jí)區(qū)別。同時(shí),以23個(gè)香氣特征成分為目標(biāo),采用六種指紋圖譜相似度計(jì)算方法,對(duì)不同等級(jí)茶樣的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,優(yōu)質(zhì)“道”系列茶樣與普通“300”系列茶樣的香氣成分GC-MS指紋圖譜相似度有較大的差異?！暗馈毕盗?個(gè)等級(jí)的茶樣指紋圖譜相似度與其等級(jí)之間有較好的相關(guān)性,隨著茶葉品質(zhì)從觀、悟、修、品逐級(jí)降低,其相似度也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。普通信陽(yáng)毛尖茶“300”系列3個(gè)等級(jí)茶樣之間存在一定的差異性,但差異程度較小,且出現(xiàn)等級(jí)交錯(cuò)現(xiàn)象。總體而言,基于香氣成分GC-MS指紋圖譜的判別分析法與相似度計(jì)算法可以從不同角度、不同層面體現(xiàn)出同一種綠茶不同等級(jí)之間的差異性,可以為綠茶的品質(zhì)區(qū)分和分等定級(jí)提供一種客觀量化的方法選擇。