氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)化妝品中25種防腐劑

孫 晶, 譚 力, 曹 玲*, 王偉國(guó), 馮有龍, 杭太俊

(1. 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院, 江蘇 南京 210019; 2. 中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 南京 210008)

為滿足我國(guó)化妝品監(jiān)管實(shí)際的需要,結(jié)合行業(yè)發(fā)展和科學(xué)認(rèn)識(shí)的提高,2015年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局組織完成了對(duì)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版,簡(jiǎn)稱《衛(wèi)生規(guī)范》)的修訂工作,編制了《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版,簡(jiǎn)稱《技術(shù)規(guī)范》, 2016年12月1日施行)。該《技術(shù)規(guī)范》定義防腐劑為以抑制微生物在化妝品中的生長(zhǎng)為目的而在化妝品中加入的物質(zhì)。一方面,防腐劑為化妝品中限用物質(zhì),過(guò)量或不適當(dāng)使用會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)[1],如過(guò)量使用甲基異噻唑啉酮(MIT)會(huì)引起接觸性皮炎[2];對(duì)羥基苯甲酸類(lèi)防腐劑隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加,雌激素屬性會(huì)隨之增加[2]。另一方面,國(guó)內(nèi)出現(xiàn)“無(wú)防腐劑添加”熱潮,實(shí)為不良媒體和商家夸大防腐劑的副作用,加入一些沒(méi)有列入防腐劑準(zhǔn)用清單但具有防腐活性的物質(zhì)[2,3],誤導(dǎo)消費(fèi)者。

必須明確化妝品確實(shí)需要具有防腐效能的物質(zhì)存在,但應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管,《技術(shù)規(guī)范》在編排時(shí)通過(guò)與全球主要國(guó)家和地區(qū)化妝品相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)分析,列出了允許使用的防腐劑準(zhǔn)用組分清單,細(xì)化和調(diào)整了化妝品中防腐劑的禁限用組分要求[4],從原《衛(wèi)生規(guī)范》中收錄的56種準(zhǔn)用防腐劑修訂減少至51種,刪除了氯乙酰胺、聚季銨鹽-15、烏洛托品等5種防腐劑[4];但是《技術(shù)規(guī)范》所列出的防腐劑測(cè)定方法卻不能滿足防腐劑監(jiān)管的需要,這在近幾年國(guó)家風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)防腐劑的測(cè)定中逐漸暴露。如實(shí)際測(cè)定的防腐劑種類(lèi)與配方標(biāo)簽不符,可能是因?yàn)榕浞教砑恿康陀诜椒z出限,或方法專屬性差,無(wú)法排除基質(zhì)干擾,易造成誤判[5]。《技術(shù)規(guī)范》中“ 防腐劑檢測(cè)方法”項(xiàng)下共收錄11種防腐劑的檢測(cè)方法(共能測(cè)定27種防腐劑)。但尚有許多配方中有使用和標(biāo)注但《技術(shù)規(guī)范》未收載檢驗(yàn)方法的情況。它們多為高效液相色譜法,個(gè)別為氣相色譜法,由于大多數(shù)防腐劑相對(duì)分子質(zhì)量小于200,且共軛體系簡(jiǎn)單,紫外光譜特征不明顯,故HPLC-UV的專屬性和靈敏度均較差;僅有苯甲醇和苯甲酸相關(guān)方法項(xiàng)下收錄了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，用于GC和LC測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)的驗(yàn)證方法。為加強(qiáng)監(jiān)管效力,填補(bǔ)監(jiān)管空白,有必要建立更廣泛、更專屬、更靈敏、高通量的防腐劑測(cè)定方法。目前文獻(xiàn)報(bào)道的化妝品中防腐劑的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7,8]、液相色譜法[9,10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11,12]和毛細(xì)管電泳法[13,14]等。

本文參考《技術(shù)規(guī)范》收載方法，即日常監(jiān)管覆蓋的防腐劑種類(lèi)和準(zhǔn)用防腐劑目錄,對(duì)市面上常用防腐劑進(jìn)行調(diào)研選擇,并加入部分具有防腐效能的物質(zhì),建立了一種靈敏度高、專屬性良好的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法,可以同時(shí)測(cè)定并確證25種常見(jiàn)防腐類(lèi)物質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 7890/7000B氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、0.22 μm有機(jī)相濾膜(美國(guó)Agilent公司); XP6百萬(wàn)分之一分析天平、十萬(wàn)分一天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司);萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司); KQ_300型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,超聲頻率:40 KHz;超聲功率:300 W); ST 16R高速離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司); Milli-Q高純水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司)。

甲醇為色譜純,由德國(guó)Merck公司提供;無(wú)水硫酸鈉、L(+)-抗壞血酸為分析純,均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。105批供試化妝品均為市售樣品。

25種防腐劑對(duì)照品的信息見(jiàn)表1,其中苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯、對(duì)羥基苯甲酸異丙酯、脫氫乙酸購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司,1,3-二羥甲基-5,5-二甲基海因(DMDMH)購(gòu)自山東西亞化學(xué)股份有限公司,2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,其余防腐劑均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(IS):苯酚(批號(hào)31016,純度99.9%)、2-辛醇(批號(hào)94900,純度98.0%)和七氯(批號(hào)118148,純度99.0%)均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:取苯甲醇、苯氧乙醇、苯氧異丙醇對(duì)照品各約80 mg,甲基異噻唑啉酮、甲基氯異噻唑啉酮、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)對(duì)照品各約20 mg,其他對(duì)照品各約40 mg,置于同一100 mL棕色量瓶中,加入0.1 mg/mL L(+)-抗壞血酸甲醇溶液適量,溶解并稀釋至刻度,混勻。

表 1 25種防腐劑的試藥信息和使用限度Table 1 Compound information and operation limits of the 25 preservatives

1) calculated on the basis of its acid; 2) total content of benzoate≤0.5%; 3) total content of parabens≤0.8%; /: no provision in the regulation.

混合內(nèi)標(biāo)溶液:取3種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)各約4 mg,置于10 mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,混勻。

1.3 樣品前處理

取混勻的化妝品試樣約0.2 g(帶有載體的面膜,去除載體后混勻),精密稱定,置于具塞離心管中,加入混合內(nèi)標(biāo)溶液100 μL,再加入0.1 mg/mL L(+)-抗壞血酸甲醇溶液10 mL,渦旋30 s,再加入無(wú)水氯化鈉約0.50 g,超聲提取20 min,振搖混勻,以5 000 r/min離心5 min,上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液作為待測(cè)溶液。

1.4 分析條件

HP-5MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;分流比10∶1;載氣:He;載氣流速:1.0 mL/min。程序升溫:初始溫度為60 ℃,保持2 min,以30 ℃/min的速率升溫至120 ℃,保持4 min,再以20 ℃/min的速率升溫至160 ℃,保持8 min,最后再以45 ℃/min的速率升溫至280 ℃,保持3.5 min。進(jìn)樣體積:1.0 μL。

電離源：EI源;離子源溫度：230 ℃;傳輸線溫度：250 ℃;電子能量：70 eV;溶劑延遲時(shí)間：4 min;選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。其他參數(shù)見(jiàn)表2。

表 2 25種防腐劑的保留時(shí)間(RT)、離子對(duì)和豐度比Table 2 Retention times (RTs), ion pairs and abundance ratios of the 25 preservatives

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.1.1進(jìn)樣口溫度的優(yōu)化

考察進(jìn)樣口溫度分別為200、220、240、260和280 ℃時(shí)各目標(biāo)化合物的響應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),針對(duì)苯甲酸和脫氫乙酸,當(dāng)進(jìn)樣口溫度為200 ℃時(shí),響應(yīng)較低,當(dāng)進(jìn)樣口溫度升至240 ℃時(shí),響應(yīng)和峰形明顯升高和改善,繼續(xù)升溫,無(wú)明顯改善。其他物質(zhì)在此范圍內(nèi)受進(jìn)樣口溫度影響不大。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇250 ℃。

2.1.2內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇

內(nèi)標(biāo)法測(cè)定可以顯著提高進(jìn)樣精密度,在一定程度上消除樣品提取過(guò)程和質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的誤差。實(shí)驗(yàn)初期，在10余種直鏈烷醇中選擇了出峰時(shí)間合適的正庚醇、正癸醇和正十六醇作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì),雖然實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的105批化妝品中均未檢出這些直鏈烷醇,但該類(lèi)物質(zhì)可能存在于化妝品香精中,為防止干擾,最終根據(jù)保留時(shí)間和化妝品中存在的可能性,選擇2-辛醇、苯酚和七氯作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì),又根據(jù)回收率測(cè)定結(jié)果,選擇使回收率最接近100%的物質(zhì)作為對(duì)應(yīng)目標(biāo)化合物的內(nèi)標(biāo)。苯酚作為苯甲醇、MIT、苯氧乙醇和MCIT的內(nèi)標(biāo);2-辛醇作為苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯氧異丙醇、DMDMH、脫氫乙酸、4-羥基苯甲酸甲酯、BHA和BHT的內(nèi)標(biāo);七氯作為其他物質(zhì)的內(nèi)標(biāo)。

2.1.3其他檢測(cè)條件的優(yōu)化

對(duì)程序升溫條件進(jìn)行了優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了25種防腐劑和3種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的有效分離(見(jiàn)圖1)。另外,實(shí)驗(yàn)還對(duì)各個(gè)化合物的分析時(shí)間段(segment)和駐留時(shí)間(dwell time)進(jìn)行了優(yōu)化,以保證其良好的峰形和靈敏度。

2.2 提取條件的選擇和優(yōu)化

由表1可以看出,化妝品中防腐劑的允許加入量差異較大,對(duì)于安全性較低、響應(yīng)較差的防腐劑，如甲基氯異噻唑啉酮,需要加大取樣量或進(jìn)行樣品濃縮；對(duì)于限量較高的防腐劑，如苯氧乙醇和苯甲醇,需要進(jìn)一步稀釋樣品。由于25種目標(biāo)防腐劑極性相差較大,因此沒(méi)有進(jìn)行固相萃取的嘗試。實(shí)驗(yàn)初期嘗試了氮?dú)獯蹈珊蜏p壓離心濃縮的方式處理供試品,測(cè)定結(jié)果表明苯甲醇、苯氧乙醇、苯氧異丙醇等物質(zhì)的回收率顯著降低,可能與此類(lèi)物質(zhì)揮發(fā)性高有關(guān),故最終選擇了直接溶劑提取的方式。為了兼顧各防腐劑的溶解度和與高效液相色譜法(外標(biāo)定量法)的兼容性,實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇為提取溶劑;為了保護(hù)氣相色譜柱,加入無(wú)水硫酸鈉脫水步驟;為

圖 1 25種防腐劑和3種內(nèi)標(biāo)的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the 25 preservatives and three internal standardsPeaks 1-25 and IS 1-3 were the same as that in Table 2.

了消除樣品和試劑不溶物對(duì)終濃度的影響,沒(méi)有采用定容的方式,而是采用精密加入10.00 mL的甲醇提取。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),抗氧劑(BHA、BHT、TBHQ和BHQ)、IPBC和對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的回收率均有一定程度的下降,推測(cè)與溫度上升,物質(zhì)加速氧化相關(guān),故向甲醇中加入0.1 mg/mL的L(+)-抗壞血酸作為抗氧劑。根據(jù)總離子流色譜圖基線漂移情況,將溶劑延遲時(shí)間推遲至4 min。經(jīng)驗(yàn)證,加入L(+)-抗壞血酸后樣品的回收率滿足測(cè)定要求。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍、檢出限和定量限

在最優(yōu)測(cè)定條件和提取條件下,對(duì)該方法的線性范圍、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)表3。參考限度范圍要求,配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù),由于防腐劑測(cè)定濃度跨度較大,為了準(zhǔn)確定量,采用分段回歸的方法。采用樣品空白基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液,以3倍信噪比和10倍信噪比確定方法的檢出限和定量限。25種防腐劑在其各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.995,方法的檢出限為0.08～0.99 μg/kg,定量限為0.27～3.30 μg/kg。

表 3 25種防腐劑的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限與定量限Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of the 25 preservatives

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

y: peak area;x: mass concentration, mg/L.

2.3.2方法回收率和進(jìn)樣精密度

向水、乳液和膏霜3種性狀的空白樣品中添加4個(gè)不同水平的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)行方法回收率驗(yàn)證,采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。苯甲醇、苯氧乙醇和苯氧異丙醇的添加濃度為0.040、0.16、1.0和4.0 mg/kg; MIT、MCIT和IPBC的添加濃度為0.010、0.040、0.25和1.0 mg/kg;其他對(duì)照品的添加濃度為0.020、0.080、0.50和2.0 mg/kg。結(jié)果表明,25種防腐劑的加標(biāo)回收率為82.3%～119.4%, RSD≤14.3%(見(jiàn)表4)。

表 4 (續(xù))Table 4 (Continued)

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)105批市售化妝品進(jìn)行測(cè)定,包括20批嬰幼兒護(hù)膚類(lèi)、15批美白類(lèi)、20批防曬類(lèi)、20批沐浴類(lèi)、20批面膜和10批其他非特殊類(lèi)化妝品,其中典型色譜圖見(jiàn)圖2。對(duì)所測(cè)樣品中防腐劑的使用種類(lèi)、用量范圍和使用頻率(見(jiàn)表5)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明,苯甲酸、氯苯甘醚、4-羥基苯甲酸異丁酯和MCIT存在超限添加的情況,約占總批數(shù)的6%;存在標(biāo)簽標(biāo)識(shí)與檢出結(jié)果不符的情況。防腐劑添加的種類(lèi)、添加量與化妝品種類(lèi)呈現(xiàn)一定的相關(guān)性:沐浴類(lèi)化妝品主要使用苯甲酸類(lèi)防腐劑;防曬類(lèi)化妝品主要使用對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)防腐劑;嬰兒護(hù)膚類(lèi)主要使用苯氧乙醇;MCIT主要在沐浴類(lèi)化妝品檢出;面膜類(lèi)化妝品中防腐劑含量較少。BHT在所有防曬類(lèi)化妝品中均有檢出,但標(biāo)簽標(biāo)識(shí)的只有3批,該類(lèi)抗氧劑容易光降解,存在安全風(fēng)險(xiǎn)[8], 《技術(shù)規(guī)范》并未指明其限度,后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和監(jiān)管。

圖 2 實(shí)際化妝品樣品中25種防腐劑的典型TIC圖Fig. 2 Typical total ion chromatograms of the 25 preservatives in cosmetics samplesPeaks 3, 5, 6, 11, 13, 14, 17, 20, 21, 23 and 25 were the same as that in Table 1.

Compound Contents/(μg/kg)Baby skin care (n=20)Bathing (n=20)Sunscreen (n=20)Facial mask (n=20)Whitening (n=15)Others (n=10)Detection rate/%Benzoic acid15357-626627-718-3184227-4831.4Methyl benzoate------0Ethyl benzoate-5-16371)-1-531)-141)20.0Phenyl benzoate------0Benzyl benzoate-2-851)27-441)-461)-7.6Benzoates1531)13-79041)27-711)1-3711)42-461)27-621)38.1Methylparaben190-10641)1-4471)338-13431)31-36131)30-14111)110-6981)53.3Ethylparaben4461)951)21-3971)191)4221)4161)12.4Isopropyl paraben------0Propylparaben25-4081)28-541)153-7771)28-741)24-4031)1451)30.5Isobutylparaben-461)401)---1.9Butylparaben3651)731)621)---2.9Parabens111-18751)1-6681)360-21221)19-36131)55-22361)110-11141)58.1Benzyl alcohol-14-7803-1152-72-7615.2Phenoxyethanol1142-420564-563762-575956-2819130-5603380-526154.3Phenoxyisopropanol-19-17-19--2.9MIT7-807-9544-9410-8358-758-8434.3MCIT-6-22---7-181.9Benzyl salicylate31-381)8-4131)25-401)-411)109-1931)16.2Dehydroacetic acid1959-----1.0IPBC2-178-757-21-6-10615.2Chlorphenesin15904775145-340932-223231128.6DMDMH3312---1983-1.9BHA51-2-10-5-384-7.6BHT1-2491-8247-327-1-301746.7TBHQ------0BHQ------0

1): calculated on the basis of its acid; -: not detected.

3 結(jié)論

本研究建立了GC-MS/MS同時(shí)測(cè)定化妝品中25種防腐類(lèi)化合物的檢測(cè)方法,與《技術(shù)規(guī)范》收載方法相比,具有高專屬性、高靈敏度和高通量性的特點(diǎn),可以同時(shí)完成定性和定量,適用于多種基質(zhì)、多種防腐劑同時(shí)使用的化妝品的測(cè)定,為化妝品中防腐劑的綜合監(jiān)控和管理提供了高效、可靠的技術(shù)支持。